论文部分内容阅读
随着我国城市化的不断发展,农村劳动力日渐短缺,杂交水稻制种成本居高不下,因此实现杂交水稻制种的机械化成为了杂交水稻产业发展的根本出路。迄今为止,科学家们已研发出多套杂交水稻机械化制种技术体系,如基于父母本之间粒型、粒色、除草剂敏感差异的杂交稻机械化制种技术,但是目前都尚未实现大规模产业化。本研究设计了以通过叶绿体转化构建的质体荧光标记为基础的杂交稻机械化制种的技术方案。首先利用基因组编辑技术提高叶绿体转化效率,旨在建立稳定高效的水稻叶绿体转化体系。再将荧光标记基因转入水稻恢复系的叶绿体中建立具有转基因生物安全性的混播混收机械化制种技术体系。同时在叶绿体转化效率难达预期的情况下,本研究又设计了将除草剂敏感基因应用于智能雌性不育系的试验方案,用于解决雌性不育系败育不彻底的问题。针对优良恢复系,利用基因组编辑技术同步敲除水稻花粉管发育基因（POLLEN TUBE BLOCKED 1,PTB1）、水稻细胞色素P450单加氧酶基因（Herbicide Susceptible lethality,Bel）以及水稻甜菜碱醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenase,Badh2）基因,快速创制除草剂敏感的智能雌性不育系,建立实用型的基于雌性不育的杂交稻混播混收机械化制种技术体系。主要研究结果如下:（1）将规律成簇间隔短回文重复（lustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）和Cas9核酸酶（CRISPR-associated protein 9,Cas9）构成的基因编辑技术应用于相对成熟的烟草叶绿体转化体系中,通过对叶绿体基因组的定点剪切来提高重组效率,研究发现基因编辑系统无论是瞬时表达还是稳定表达均能有效的提高叶绿体转化的效率。构建了以烟草叶绿体转化同源重组片段中间序列为靶位点的CRISPR/Cas9系统载体,将该基因编辑系统以两种形式应用于烟草叶绿体转化。一种形式是将基因编辑系统载体与烟草叶绿体转化载体共转化,该系统不会整合进叶绿体基因组,而是在叶绿体中进行瞬时表达。另一种形式是将基因编辑系统构建到烟草叶绿体转化载体上同源重组片段之间,通过叶绿体转化整合进入烟草叶绿体基因组,在叶绿体中稳定表达。结果显示CRISPR/Cas9系统在叶绿体中瞬时表达能提高叶绿体转化效率6.74倍,而稳定表达能提高10.82倍。（2）构建了包含CRISPR/Cas9系统的水稻叶绿体转化载体,并通过基因枪方法导入水稻愈伤组织中,获得了抗性愈伤组织和转基因苗。先将针对水稻叶绿体转化同源重组位点设计的基因编辑系统整合至水稻叶绿体转化载体中,在大肠杆菌原核系统中验证了原核启动子prrn驱动的筛选基因潮霉素磷酸转移酶基因（hptromycin phosphotransferase II,hpt）、标记基因增强绿色荧光蛋白基因（Enhanced Green Fluorescent Protein,e GFP）和Cas9基因的表达。然后对比了六种激素对水稻愈伤增殖和再分化的影响,选择IBA和TDZ进行两因素五水平的正交实验优化水稻分化培养基中的激素配比。实验结果显示在含2.5mg/L IBA和0.5 mg/L TDZ的分化培养基上愈伤组织绿化效率最高。分化培养基的优化为水稻叶绿体转化提供了合适的受体材料。最终通过基因枪转化方法将叶绿体转化载体导入水稻叶绿体中,经过抗性筛选获得了抗性愈伤。再经过多轮筛选后将抗性愈伤组织转入分化培养基中,分化获得抗性苗,PCR分子检测验证为阳性转基因植株。但是该体系的转化效率仅有0.25%,每个转基因株系平均需要33.33次轰击。并且同质化程度较低,在无筛选压力下无法稳定遗传给后代。（3）以优良恢复系为受体,利用CRISPR/Cas9技术获得了PTB1、Bel和Badh2 3个基因的纯合突变体,并通过结实率统计、苯达松敏感性实验和气质联用等方法确认了突变体具有雌性不育和苯达松敏感性,以及具有香味性状,适用于基于雌性不育的杂交稻机械化制种技术。针对3个基因的5个靶位点构建了多靶标基因编辑载体（Badh2只有一个靶位点）,通过农杆菌介导的遗传转化获得明恢86、华占、圳8B、雅占和R278 5个品种的转基因植株。由于采用了双靶标基因编辑系统,3个基因的突变率分别达到82.35%、76.47%和94.11%,表明双靶标基因编辑系统具有高突变效率。通过分子检测筛选获得了缺失突变、碱基插入以及长片段缺失等不同类型的突变体。转基因植株进一步自交和分子检测获得不含转基因载体的PTB1、Bel和Badh2 3基因纯合突变体。突变体表型考察显示在灌浆期稻穗直立,自交结实率极低,且花粉育性正常,符合雌性不育表型;苯达松喷施实验结果表明突变体对苯达松敏感致死,幼苗期喷施2400 mg/L的苯达松溶液即可将突变体杀灭;另外,突变体叶片和种子带有明显的香味,其中种子中香味物质2-AP的含量明显高于对照组。（4）通过杂交转育的方法将智能雌性不育系的PTB1育性恢复表达盒、花粉致死基因表达盒和红色荧光标记基因表达盒3个连锁表达盒导入PTB1、Bel和Badh2 3基因突变体中,得到苯达松敏感型智能雌性不育系。以突变体为父本,与带有连锁表达盒的转基因植株进行杂交,杂交后代通过荧光筛选、分子检测获得了不同背景的三基因纯合突变的苯达松敏感型智能雌性不育系,包括明恢86、华占,圳8B、雅占和R278 5个恢复系。这一技术体系可以将优良恢复系快速改造为苯达松敏感型智能雌性不育系,其自交繁育种子通过荧光筛选分离出的非转基因种子即可作为恢复系应用于机械化制种当中。通过机械化制种得到的杂交稻在育秧时喷施苯达松可以去除父本自交结实得到非杂交种幼苗,保障了制种纯度,解决了雌性不育系败育不彻底的问题。