喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤,在世界范围内,喉癌的发病率居于全身恶性肿瘤的第十一位。目前,手术和放射治疗仍然是治疗喉癌的主要手段;化学治疗对局部控制率的提高和预后的改善作用尚需进一步的研究。在过去的几十年,随着各种喉功能保留措施的应用,喉全切除术的应用正在逐渐减少,但是喉癌的生存率没有大的提高。因此,进一步研究喉癌发生、发展的分子生物学机制,发现其肿瘤标志物及临床意义,对于喉癌的预防、诊断、预后评价和化疗药物选择将有重大的意义。表皮生长因子受体(EGFR)具有酪氨酸蛋白激酶(PTK)活性,其信号转导通路的异常与肿瘤增殖、浸润、细胞迁移、血管生成、抗凋亡有关。EGFR是TGF-α和EGF的共同受体,但EGF的活性远远低于TGF-α。EGFR信号转导通路主要有:Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK通路、PI3K/PDK1/Akt(PKB)通路、PLC-γ通路、JAK/STAT通路。Stat3是STATs家族的重要成员。Stat3蛋白在细胞质中呈潜伏状态,通过酪氨酸磷酸化被激活,磷酸化Stat3形成同源或异源性二聚体,转运至细胞核,发挥促进转录的作用。在正常细胞,Stat3的激活是个短暂的过程,只持续数分钟至数小时。目前已经发现Stat3在人体多种原发肿瘤和细胞系中均有激活,并被定义为癌基因。目前,头颈部鳞癌癌变的具体机制还不十分清楚,关于喉癌组织中TGF-α、EGFR/Stat3信号传导通路情况相互关系,国内外尚未见专题报道。目的为了明确喉癌组织中Stat3表达和激活情况、活化的Stat3与TGF-α、EGFR表达关系。材料与方法一、实验材料收集2007年3月至2008年10月之间中国医科大学附属盛京医院耳鼻咽喉科62例喉癌手术标本。对照组:选取其中的13例喉全切除术标本中,距离肿瘤边缘＞1.0cm的粘膜组织作为对照组。二、实验方法(一)RT-PCR检测EGFR mRNA、TGF-αmRNA和Stat3 mRNA表达Trizol一步法提取总RNA。cDNA合成后进行PCR扩增EGFR基因引物序列为:5’-GCCAAGGCACGAGTAACAAGC-3’(上游),5’-AGGGCAATGAGGACATAACCAG-3’(下游),扩增长度187bp;TGF-α基因引物序列为:5’-CAGGGTGCGGAGATGGAAC-3’(上游),5’-CGAGGGCTCACGAGGAAGT-3’(下游),扩增长度253bp;Stat3基因引物序列为:5’-CACCAAGCGAGGACTGAGCAT-3’(上游),5’-GCCAGACCCAGAAGGAGAAGC-3’(下游),扩增长度149bp;β-actin引物序列为:5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’(上游),5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’(下游),扩增长度510bp。(二)Western印迹检测EGFR、TGF-α、Stat3及p-Stat3蛋白表达取组织块提取细胞总蛋白,10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转印后用EGFR、TGF-α、Stat3、p-Stat3和抗β-actin单克隆抗体孵育。加入用碱性磷酸酶标记的相应二抗,显色后置于UVP-8000凝胶成像仪成像。(三)免疫组化检测EGFR、TGF-α、Stat3、p-Stat3蛋白表达采用链霉菌抗生物素蛋白—过氧化酶连接(SP)免疫组织化学方法,实验步骤按试剂盒说明书进行。(四)统计学分析应用SPSS 11.5软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,两组均数比较时用独立样本t检验;计数资料采用x~2检验;双变量相关性分析采用Pearson相关分析。结果1、免疫组化EGFR蛋白细胞膜和细胞质均有着色;62例癌组织中阳性77.4%,其中弱阳性38.7%,中度阳性21.0%,强阳性17.7%;13例对照粘膜组织中阴性84.6%,弱阳性15.4%;二者之间差异具有统计学意义(x~2=18.610,P=0.000)。2、Western印迹62例喉癌组织和13例对照组织中均有EGFR蛋白的表达,喉癌组织与对照组织中EGFR蛋白表达值分别为110.67±21.63和54.80±6.59,二者之间差异具有统计学意义(t=9.178,P=0.001)。3、62例喉癌组织和13例对照组织中均有EGFR mRNA的表达。喉癌组织与对照组织中EGFR mRNA表达值分别为70.49±17.09和31.99±2.99,二者之间差异具有统计学意义(t=8.055,P=0.000)。4、免疫组化TGF-α蛋白细胞质着色;62例癌组织中阳性46.8%,其中弱阳性22.6%,中度阳性19.4%,强阳性4.8%;13例对照粘膜组织92.3%为阴性,7.7%为弱阳性;二者之间差异具有统计学意义(x~2=6.839,P=0.009)。5、Western印迹62例喉癌组织和13例对照组织中均有TGF-α蛋白的表达,喉癌组织与对照组织中TGF-α蛋白表达值分别为84.14±15.04和38.19±3.96,二者之间差异具有统计学意义(t=10.879,P=0.000)。6、62例喉癌组织和13例对照组织中均有TGF-αmRNA的表达。喉癌组织与对照组织中TGF-αmRNA表达值分别为49.69±10.09和25.99±2.15,二者之间差异具有统计学意义(t=8.383,P=0.000)。7、EGFR蛋白与TGF-α蛋白正相关,Pearson相关系数为0.896,显著性检验P=0.000。8、免疫组化Star3蛋白细胞质和细胞核均有着色;62例癌组织中阳性61.3%,其中弱阳性25.8%,中度阳性21.0%,强阳性14.5%;13例对照粘膜组织均为阴性;二者之间差异具有统计学意义(x~2=16.151,P=0.000)。9、免疫组化p-Stat3蛋白细胞核着色;62例癌组织中阳性43.5%,其中弱阳性16.1%,中度阳性19.4%,强阳性8.1%;13例对照粘膜组织均为阴性;二者之间差异具有统计学意义(x~2=8.846,P=0.003)。10、Western印迹62例喉癌组织和13例对照组织中均有Star3、p-Stat3蛋白的表达,喉癌组织与对照组织中Stat3、p-Stat3蛋白表达值分别为114.91±25.45和70.65±9.53、57.64±17.67和13.77±2.33,二者之间差异具有统计学意义(t=6.152,P=0.000)和(t=8.890,P=0.000)。11、62例喉癌组织和13例对照组织中均有Stat3 mRNA的表达。喉癌组织与对照组织中Stat3 mRNA表达值分别为68.34±10.59和33.49±2.61,二者之间差异具有统计学意义(t=11.721,P=0.000)。12、EGFR蛋白与p-Stat3蛋白正相关,Pearson相关系数为0.698,显著性检验P=0.000。结论1、喉癌组织中存在EGFR mRNA和蛋白的高表达。2、喉癌组织中存在TGF-αmRNA和蛋白的高表达。3、喉癌的发生和发展中可能存在TGF-α、EGFR自分泌环4、喉癌组织中活化的p-Stat3、Stat3 mRNA和蛋白高表达5、喉癌EGFR同Stat3信号激活存在联系。