[研究目的]在全球范围内,乳腺癌作为女性发病率以及死亡率最高的恶性肿瘤之一,美国癌症协会(the American Cancer Society)统计的最新结果发现,乳腺癌占癌症相关死因的14%;在我国乳腺癌的发病率也呈逐年递增的趋势,并且发病年龄越来越年轻化[1]。大约65-75%的乳腺癌患者是雌激素受体(estrogen receptor)或孕激素受体(progesterone receptor)阳性的。激活雌激素受体信号通路影响70%的乳腺癌患者。因此,内分泌治疗对于此类乳腺癌患者是最重要的治疗方式[2]。他莫昔芬是进40年来最具有代表性的选择性受体调节剂。对于雌激素受体阳性的乳腺癌患者,无论是绝经前或绝经后患者,坚持使用他莫昔芬5年,能够有效降低复发率,减少接近1/3的死亡率,据最新研究显示,持续使用他莫昔芬10年以上,能有效降低患者的复发率和死亡率[3]。但是令人担忧的是,他莫昔芬耐药仍然是治疗雌激素依赖乳腺癌的最大隐患[3-4]。接近有1/3的病人在他莫昔芬治疗初期就产生了抵抗,大部分的病人在使用后期产生了药物耐药性[5-6]。临床治疗中,增强乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性,防止乳腺癌患者产生耐药性是亟待解决的重大问题,对乳腺癌治疗意义深远。脂肪抑制素(又称作125B11)可以阻断SCAP从内质网到高尔基体的转运[7]。相关机制研究表明脂肪抑制素可以与SCAP直接结合,特异性阻断SCAP在高尔基体上的糖基化,表明脂肪抑制素可以抑制SCAP从内质网转运至高尔基体[8]。根据文献报道,通过MTT检测脂肪抑制素对雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系和雌激素受体阴性的乳腺癌细胞系IC50发现,雌激素受体阴性的乳腺癌细胞系IC50是雌激素受体阳性乳腺癌细胞系的8倍,表明脂肪抑制素对雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系效果更显著[9]。那么脂肪抑制素是如何在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系中发挥作用的呢?脂肪抑制素与他莫昔芬联合使用是否会增强雌激素受体阳性乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性呢?其分子机制值得我们进一步探索。本研究首次在裸鼠体内,通过裸鼠成瘤实验发现脂肪抑制素可以增强雌激素受体阳性的乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性,并且在分子生物学基础水平上,首次探讨脂肪抑制素可以通过泛素化途径降解雌激素受体,抑制乳腺癌发生发展过程,阐明了脂肪抑制素通过多聚泛素化途径降解雌激素受体阳性的乳腺癌细胞的分子机制以及与他莫昔芬联合使用对雌激素受体阳性乳腺癌的影响,为乳腺癌患者联合用药提供重要的理论依据。[研究方法及结果]在本课题中,我们对脂肪抑制素增强雌激素受体阳性乳腺癌对他莫昔芬的敏感性进行了全面深入的研究,并阐明脂肪抑制素诱导雌激素受体降解的的机制,具体研究主要包括以下五部分:第一部分:脂肪抑制素与他莫昔芬联合使用对裸鼠成瘤能力的影响实验方法:为了进一步探究脂肪抑制素能够增强雌激素受体阳性的乳腺癌对他莫昔芬的敏感性,我们通过裸鼠成瘤的方法,同时使用灌胃法和腹腔注射法治疗成瘤的裸鼠,利用动物实验进一步验证脂肪抑制素对雌激素受体阳性的乳腺癌的抑制作用。通过免疫组织化学染色方法,检测Ki67,雌激素受体,LC3的表达情况。提取各组瘤体蛋白,通过蛋白质免疫印迹实验检测雌激素受体蛋白,自噬相关标志蛋白,以及凋亡相关标志蛋白的表达情况。实验结果:通过裸鼠成瘤实验发现,脂肪抑制素可以抑制雌激素受体阳性的乳腺癌增殖能力,同时可以增强雌激素受体阳性的乳腺癌对他莫昔芬的敏感性。利用免疫组织化学染色发现,两药联合后Ki67表达量降低,雌激素受体表达量降低,自噬标志蛋白LC3表达量增加。通过蛋白质免疫印迹实验发现自噬相关蛋白表达量增加,凋亡相关蛋白表达量增加,雌激素受体表达量下降。第二部分:脂肪抑制素与他莫昔芬联合使用可以抑制雌激素受体阳性的乳腺癌细胞的增殖能力并诱导周期阻滞研究方法:为了研究脂肪抑制素是否对乳腺癌的发生发展有抑制作用,并进一步探究其作用的分子机制,为了研究脂肪抑制素是否能增强雌激素受体阳性的乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性,我们利用MTT实验,在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系MCF-7和T47D中,加入浓度梯度的他莫昔芬和脂肪抑制素,以及两药联合使用,检测细胞生长情况。并通过克隆形成实验,检测两药联合对雌激素受体阳性的乳腺癌细胞的克隆形成的影响。为了研究脂肪抑制素联合他莫昔芬是否能通过引起雌激素受体阳性的乳腺癌细胞周期阻滞,我们通过流式细胞术检测细胞周期。通过western blot实验验证两药联合是否通过调控cyclinD1和cyclinB1发挥作用。研究结果:通过MTT实验检测脂肪抑制素在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞以及雌激素受体阴性的乳腺癌细胞中的IC50,发现雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系对脂肪抑制素的敏感性显著优于雌激素受体阴性的乳腺癌细胞系,同时,脂肪抑制素对雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系增殖能力的抑制作用更强。进一步探究脂肪抑制素是否是通过影响雌激素水平发挥作用的。为了进一步探究脂肪抑制素是否能增强雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系对他莫昔芬的敏感性,我们通过MTT实验,设置脂肪抑制素和他莫昔芬在不同的浓度梯度和时间梯度的单药使用以及两药联合,进一步探究脂肪抑制素在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系中,可以增强他莫昔芬治疗敏感性。通过克隆形成实验,验证两种药物联合使用对雌激素受体阳性的乳腺癌细胞增殖能力有抑制作用。为了进一步探究脂肪抑制素联合tamoxien是否能通过引起雌激素受体阳性的乳腺癌细胞周期阻滞,我门通过流式细胞术检测细胞周期,实验结果显示:脂肪抑制素主要引起M2周期的阻滞,他莫昔芬主要引起M1周期的阻滞,两种药物联合使用后S期减少。通过western blot实验验证两药联合可以降低cyclinD1的表达,并升高cyclinB1的表达发挥作用。第三部分:脂肪抑制素与他莫昔芬联合使用可以诱导雌激素受体阳性的乳腺癌细胞发生凋亡和自噬及机制研究实验方法:为了进一步研究脂肪抑制素和他莫昔芬对雌激素受体阳性的乳腺癌细胞凋亡的影响,我们利用流式细胞术检测单药及两药联合对雌激素受体阳性的乳腺癌细胞凋亡影响,并通过TUNEL实验进一步验证单药及两药联合对雌激素受体阳性的乳腺癌细胞凋亡的影响;为了进一步探究脂肪抑制素和他莫昔芬对雌激素受体阳性的乳腺癌细胞自噬的影响,我们通过吖啶橙染色,自噬染料MDC对脂肪抑制素和他莫昔芬以及两药联合处理的雌激素受体阳性的乳腺癌细胞进行观察,验证脂肪抑制素对雌激素受体阳性的乳腺癌细胞自噬能力的影响。通过蛋白免疫印迹实验验证两药联合是否通过PI3K-AKT-mTOR通路影响雌激素受体阳性的乳腺癌细胞的发生发展和自噬,以及两药联合是否可以促进雌激素受体阳性的乳腺癌细胞发生凋亡。实验结果:通过吖啶橙染色,自噬染料MDC对脂肪抑制素和他莫昔芬以及两药联合处理的雌激素受体阳性的乳腺癌细胞进行观察,结果显示:脂肪抑制素和他莫昔芬联合能够促进雌激素受体阳性的乳腺癌细胞发生自噬。通过western blot实验验证两药联合可以通过PI3K-AKT-mTOR通路促进雌激素受体阳性的乳腺癌细胞的发生发展并诱导自噬发生,并且可以促进雌激素受体阳性的乳腺癌细胞发生凋亡。第四部分:脂肪抑制素与他莫昔芬联合使用可以抑制雌激素受体阳性的乳腺癌细胞的浸润转移能力实验方法:为了进一步研究脂肪抑制素和他莫昔芬对雌激素受体阳性的乳腺癌细胞迁移和浸润转移能力的影响,在MCF-7和T47D雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系中,我们进行了 transwell实验和划痕实验,验证验证脂肪抑制素、他莫昔芬以及两种药物联合使用对雌激素受体阳性的乳腺癌细胞浸润转移能力的影响。研究结果:利用划痕实验和Transwell实验,验证脂肪抑制素、他莫昔芬以及两种药物联合使用对雌激素受体阳性的乳腺癌细胞浸润转移能力的影响,结果显示:两药联合可以显著降低雌激素受体阳性的乳腺癌细胞发生浸润转移的能力。第五部分:脂肪抑制素可以降低雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系的雌激素受体表达水平研究方法:在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系MCF-7和T47D和雌激素受体阴性的乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468中加入浓度梯度的脂肪抑制素,我们利用MTT实验检测脂肪抑制素在不同乳腺癌细胞系中的IC50以及对增殖能力的影响。为了进一步探究脂肪抑制素是否通过降低雌激素受体水平影响雌激素受体阳性的乳腺癌,在MCF-7和T47D雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系中,通过蛋白免疫印迹实验,探究脂肪抑制素在时间和药物浓度的基础上,对雌激素受体蛋白水平表达的影响。同时在蛋白水平通过分别加入放线菌酮、MG132和氯喹,验证脂肪抑制素是通过抑制蛋白合成发挥作用还是通过加速蛋白酶体途径降解的或溶酶体途径降解雌激素受体的。通过免疫共沉淀实验验证脂肪抑制素通过泛素化途径降解雌激素受体。研究结果:通过蛋白免疫印迹实验,发现脂肪抑制素可以在蛋白水平降低雌激素受体的表达,具有时间依赖性和浓度依赖性。使用放线菌素D设置不同的时间梯度,利用实时定量PCR技术发现脂肪抑制素可以部分通过抑制雌激素受体的转录发挥作用。分别使用放线菌酮(CHX)、蛋白酶抑制剂(MG132)以及溶酶体抑制剂(氯喹)后,设置不同的时间梯度,发现脂肪抑制素是通过蛋白酶体途径加速雌激素受体降解的。免疫共沉定实验(COIP)进一步验证脂肪抑制素是通过泛素化途径加速雌激素受体降解的。[结论]1.脂肪抑制素和他莫昔芬联合增强对裸鼠成瘤能力的抑制作用2.脂肪抑制素可以显著抑制雌激素受体阳性的乳腺癌细胞的增殖能力3.脂肪抑制素可以增加雌激素受体阳性的乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性,抑制增殖能力和浸润转移能力,诱导凋亡和周期阻滞4.脂肪抑制素可以增强他莫昔芬诱导雌激素受体阳性的乳腺癌细胞发生自噬的能力,并通过靶向PI3K-AKT-mTOR通路发挥作用5.脂肪抑制素可以通过泛素化途径加速雌激素受体的降解[意义]1.证明脂肪抑制素可以通过增加雌激素受体阳性的乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性发挥作用,为乳腺癌临床辅助治疗提供理论依据。2.首次证明了脂肪抑制素通过泛素化途径降低雌激素受体表达,并抑制雌激素受体阳性的乳腺癌细胞发生发展。