L-精氨酸高产菌株发酵条件的优化

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L-精氨酸是一种条件必需型氨基酸,对成年人和动物来说不是必需的,但它在婴幼儿或幼龄动物中合成不足,是必需氨基酸,因此,在饲料和婴幼儿食品中广泛添加。L-精氨酸还在控制血管收缩与扩张、降低血压、刺激内分泌系统、促进免疫和维持营养平衡等方面有着显著的功能,在医药、食品等行业上都有着广泛的应用。L-精氨酸的主要生产方法有化学合成法、蛋白质水解法和发酵法。日本等国家在氨基酸生产方面一直处于领先地位,多采用成本低、污染小的发酵法生产L-精氨酸。而我国L-精氨酸的发酵生产起步较晚,生产菌种和发酵条件的控制相对落后,当前多采用污染较大、产品纯度较低的蛋白质水解法来生产L-精氨酸。本文以实验室保藏的Brevibacterium flavum B-003为出发菌株,通过实验,使出发菌株的产量达到35.8g/L,与刘建成等利用基因工程菌E.coli LGE35在5L发酵罐发酵96h相比,产量提高了86.4%;与苏令鸣等利用黄色短菌在20L发酵罐发酵72h相比,产量提高了17.3%。实验不仅使L-精氨酸的产量达到工业化生产的要求,也对发酵法生产的条件控制进行了初步的探索。实验主要对菌种的复壮、种子培养条件的优化、摇瓶发酵培养条件的优化和10L全自动发酵罐中L-精氨酸发酵条件的优化进行了研究。(1)菌种的复壮由于菌种的长期保藏和使用,导致退化菌体的比例上升,在生产中表现为菌体生长变慢、生活力下降、产量降低,为保持菌种的优良性状,实验通过平板划线法对菌种进行复壮,筛选出菌体生长较快的、L-精氨酸产量较高的菌株Brevibacterium flavum B-004。(2)种子培养条件的优化为获得大量的、高活力的菌种,本实验分别通过单因素和正交实验对培养基成分和培养条件进行优化,得出最佳的种子培养基成分和培养条件为:葡萄糖35.0g/L、硫酸铵30.0g/L、七水硫酸镁0.4g/L、玉米浆25.0mL/L、三水磷酸二氢钾1.5g/L、初始pH为7.0、种龄18.0h、装液量20.0mL。(3)摇瓶发酵培养条件的优化本实验主要通过单因素实验和响应面试验对菌株生长所需的发酵培养基及其培养条件进行优化。通过实验得出最佳的培养基成分和培养条件为:葡萄糖99.6g/L、玉米浆20.0mL/L、七水硫酸镁0.5g/L、硫酸铵60.8g/L、三水磷酸二氢钾0.25g/L、碳酸钙5.0%、温度30.0℃、初始pH为7.0、接种量10.0%。Brevibacterium flavum B-004产量达到24.5g/L,与最初培养条件相比L-精氨酸产量提高了60.9%,与郝刚等利用谷氨酸棒杆菌发酵72h相比,产量提高了49.3%;与路志强等利用谷氨酸产生菌钝齿棒状杆菌发酵96h相比,产量提高了12.9%;与贺小贤等利用北京棒杆菌发酵76h,产量提高了79.6%。(4)10L全自动发酵罐中L-精氨酸发酵条件的优化对10L全自动发酵罐中L-精氨酸发酵条件的优化结果表明,通气比为1:0.75vvm、pH控制在7.0左右、初始葡萄糖浓度为50.0g/L时,L-精氨酸产量较高。对葡萄糖流加初步研究表明从在12h、24h、36h、48h、60h补加2.0%葡萄糖,使总糖量达15.0%,产量达到35.8g/L,与摇瓶发酵相比L-精氨酸产量提高了46.1%;与刘建成等利用基因工程菌E.coli LGE35在5L发酵罐发酵96h相比,产量提高了86.4%;与苏令鸣等利用黄色短菌在20L发酵罐发酵72h相比,产量提高了17.3%。
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