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醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase，ADH)已被发现存在于很多物种中。哺乳类动物的ADH在多种初级，二级和芳香族醇类的氧化中发挥作用，但是其最重要的作用是催化乙醇代谢的初始反应，因此在防止乙醇引起的肝损伤方面具有重要意义。人类肝脏Ⅰ类ADH对乙醇表现高氧化活性，在乙醇代谢中发挥主要作用。Ⅰ类ADH由ADH1，ADH2和ADH3组成，它们分别由3个基因编码。人们对人及其它多种哺乳动物的ADH进行了大量研究，取得了突破性进展。然而，对人Ⅰ类ADH在分子组成、结构以及乙醇代谢机理等领域仍存在相当多的疑问。在基因诊断方面，由于过量饮酒作为各种乙醇相关疾病主要病因的确立，近年来对醇代谢酶遗传多态与各乙醇相关疾病易感性关系的研究取得了可喜进展。然而，国内相关研究十分有限，结果多存在差异甚至矛盾，严重阻碍了其实际应用。
为今后深入探讨其分子生物学特性及其代谢机理，为初步确定遗传因素对我国东北地区汉族男性乙醇相关疾病易感性的影响，从而为本地区此类疾病的基因检测提供可行的方法并为此类疾病今后的预防控制及病理研究奠定分子基础，本试验以人Ⅰ类ADH及醇代谢酶多态基因为研究对象进行研究。
本试验根据基因序列的高度同源性设计了一对引物，利用RT-PCR技术同时获得了人醇脱氢酶Ⅰ类基因全长cDNA(ADH)克隆。为了鉴定cDNA片段，设计了一对特异的引物。根据这对引物克隆了-4到296的ADH序列，并分别使用KpnⅠ和PstⅠ酶切直接鉴定cDNA序列。获得的ADH开放阅读框均为1128bp，编码375个氨基酸。与GenBank上已公布的序列比较，证实获得的醇脱氢酶为ADH1、ADH2*1和ADH3*2，与已公布序列同源性分别为100％、99.91％和100％；氨基酸序列同源性分别为100％、99.73％和100％。ADH2*1的第946位碱基由G变成A，导致其氨基酸发生改变，即第316位氨基酸由K变为E。
以pTYB11为载体，利用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点成功构建了人醇脱氢酶Ⅰ类基因的原核表达载体，将其导入宿主菌ER2566中获得表达。最佳诱导时间分别为8hr、4hr和6hr，温度为16℃，IPTG浓度为0.5mmol/L。ADH1、ADH2*1和ADH3*2蛋白表达量分别占总蛋白的10.2％、11.8％和11.2％。
利用Chitin纯化柱分别纯化宿主菌ER2566中表达的ADH1、ADH2*1以及ADH3*2，均获得了分子量约为40000的目的蛋白。据测定，纯化的重组酶ADH1、ADH2*1和ADH3*2的蛋白质浓度范围分别是0.08～0.13mg/mL、0.06～0.11mg/mL和0.15～0.20mg/mL。在25℃，pH7.5的100mmol/L磷酸钠溶液中测定重组酶的A340nm，以酵母醇脱氢酶为标准蛋白，比较计算三种重组酶制剂的酶活力，结果ADH1、ADH2*1和ADH3*2的酶活力分别为1.8U/mg、0.9U/mg和1.4U/mg。本实验分别测定了三种重组酶在25℃，pH7.5的100mmol/L磷酸钠溶液中的动力学参数，发现重组酶ADH1、ADH2*1和ADH3*2的Vmax值分别为38min-1、4min-1和32min-1；Km(NAD+)值分别为0.015mmol/L、0.016mmol/L和0.730mmol/L；Km(EtOH)值分别为3.914mmol/L、0.052mmol/L和0.596mmol/L，均具有与肝脏组织分离的ADH相似的动力学特性。
配制不同pH的缓冲液，测定25℃下，乙醇为底物时重组酶的酶活力。绘制平均相对酶活力与pH的关系曲线，确定ADH1、ADH2*1及ADH3*2催化乙醇代谢反应的最适pH值分别为9.5、10.0和9.5。同样，测定乙醇为底物时，重组酶在不同温度下，100mmol/LpH7.5的磷酸钠缓冲液中的酶活力。通过绘制平均相对酶活力与PH的关系曲线，确定ADH1、ADH2*1及ADH3*2催化乙醇代谢反应的最适温度为25℃。
分别配制pH值为4.0～12.0的反应缓冲液，将重组酶液在4℃上述缓冲液中贮存48hr后，测定酶活力，与pH7.5，100mmol/L磷酸钠缓冲液中储存酶活力比较，以未储存的酶活力为100％，绘制平均相对酶活力与pH的关系曲线，确定三种重组酶制剂在不同pH下的稳定性。结果发现，三种酶制剂在pH8.0～10.0的缓冲液中储存都较为稳定，48hr后可以保存原有酶活力的80％以上。但是当pH大于10.0或小于8.0时，酶活力下降显著。
将重组酶液在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃下保温20min，用100mmol/LpH7.5的磷酸钠缓冲液配制反应试剂，测定三种重组酶的酶活力，以25℃的酶活力为100％，绘制平均相对酶活力与温度的关系曲线，确定三种重组酶制剂在不同温度下的稳定性。同时将酶在4℃保存，每24hr测定一次酶活力，连续测定7d，确定三种重组酶制剂在4℃不同时间内的稳定性。结果发现，经不同温度保温20min后测定的酶活力，与25℃时的酶活力作比较，在20℃～30℃下保温酶活力损失不大，可保持原有活力的70％以上，当温度升至30℃以上，酶活力显著下降，说明该类酶对温度变化的耐受力很弱。将酶制剂在4℃保存，发现在4d内酶活力活力损失不大，可保持原有活力的75％以上，随保存时间的增加，酶活力缓慢下降，7d后酶活力降至原有酶活力的50％左右，说明酶制剂在4℃具有较好的稳定性。
本实验中应用PCR-RFLP法成功检测了东北地区汉族男性健康者(50例)、嗜酒者(50例)、ALD患者(50例)、AP患者(30例)以及嗜酒CHD患者(50例)中ADH3、ALDH2和CYP2E1的基因型并对其基因频率进行了比较。结果发现，ADH3及CYP2E1RsaⅠ/PstⅠ位点基因多态性与上述乙醇相关疾病的发生无关，等位基因ALDH2*1是东北汉族男性嗜酒的诱因，纯合子ALDH2*2/2*2可有效预防嗜酒及上述乙醇相关疾病的发生，杂合子ALDH2*1/2*2具有最高的上述疾病患病风险。