肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，近年来肺癌发病率、死亡率在世界范围内均有较大幅度的增长，究其原因是因为人们对肺癌的发病机制尚未彻底了解，缺乏有效的防治措施。因此，彻底揭示肺癌的发生发展机制，以便对其进行有效的早期预警、早期诊断、早期防治显得尤为重要。 研究资料表明：DNA甲基化机制参与了肿瘤的发生。甲基化是指DNA在甲基转移酶催化下，将甲基基团一CH3加到胞嘧啶环的第5碳原子上形成5一甲基胞嘧啶(5-mC)，多发生于基因启动子区CpG岛。真核细胞的DNA甲基化是抑制基因活性的一种重要机制，其改变了蛋白和DNA的相互作用，导致染色体结构的改变，降低基因的转录。并且有证据提示DNA甲基化发生在细胞恶变之前，因此检测DNA启动子区是否发生了高甲基化有助于早期发现突变细胞。 脆性组氨酸三联体基因(Fragile histidine traid，FHIT)是1996年由Ohta等用定位克隆技术及外显子捕获法在3p14.2发现的一种新的抑癌基因。在人类肺癌、胃肠道癌、乳腺癌等多种实体瘤中都存在FHIT基因转录产物及蛋白表达的缺失。但FHIT基因的失活机制不同于经典的抑癌基因，其在大多数肿瘤中只出现纯合子或半合子的缺失，只有极少数肿瘤可检测到点突变，因此人们将研究目光转向FHIT基因启动子甲基化区域，但国内外文献中关于FHIT基因启动子区甲基化与肺癌关系的研究则较少。郑州大学2004年硕士论文FHIT、pl6基因甲基化与肺癌关系的研究 p16基因定位于9p21不到40kb的范围内，有3个外显子和2个内含子组成，3个外显子共同编码p16蛋白，后者是Cdk4的抑制因子，能抑制细胞分裂，是迄今为止人类发现的第一个最直接的抑制肿瘤发生的固有成分。研究显示，p16基因第1外显子5’一CpG岛的甲基化在多种肿瘤的发生发展中起重要作用。 本研究采用MSP和克隆技术检测了人原发性肺癌组织，癌旁组织，正常组织及支气管鳞状化生组织中FHIT基因CPG岛甲基化状况，分析FHIT基因与人原发性肺癌发生发展之间的关系，并进一步检测pl6基因CpG岛甲基化状况，以期探讨多基因甲基化与肺癌发生之间的关系，并为肺癌早期预警或诊断提供基础资料。方法: 1.标本收集:本研究共收集59例肺癌患者的组织标本，相对应的32例肺正常组 织和15例癌旁组织，及n例支气管鳞状化生组织作FHIT基因、P16基因的 甲基化分析。 2.甲基化特异性聚合酶链技术(Methylation speeific PCR，MSP)扩增目的基 因进行基因分析。 3.应用基因克隆和DNA测序对FHIT基因启动子区DNA的异常甲基化进行分析。 4.应用SPSS10.0软件进行统计学分析处理。结果:1.FHIT基因MSP结果 提取肺癌患者的癌组织，癌旁组织和相应正常组织的基因组DNA，进行MSP扩增，甲基化率分别为38%(22/59)、20%(3/15)、0%(0/32)，三组相比差异有统计学意义(尸=0.000)。进一步做两两比较，肺癌组、癌旁组与正常组相比差异具有统计学意义(尸=0.002)。32例正常肺组织的FHrr非甲基化特异性引物的PCR扩增均为阳性。支气管鳞状化生组织的甲基化阳性率为18%，高于正常组(O%)，但两者相比差异不具有统计学意义(P>0.05)。FHIT基因甲基化率在肺癌患者吸烟组和非吸烟组中的差异无统计学意义(p>0.05)。同时，FHIT基因甲基化率在不同组织分型，不同病理分级和不同临床分期中，差异也无统计学意义(P>0.05)。2.P16基因的MSP结果 以肺癌患者的癌组织，癌旁组织和相应正常组织中提取的基因组DNA为模板，进行MSp扩增，甲基化率分别为51%(33/59)、20%(3八5)、o%(o/犯)，三组相郑州大学2004年硕士论文FHIT、P16基因甲基化与肺癌关系的研究比差异有统计学意义(尸=0.000)。进一步做两两比较，肺癌组与正常组的pl6甲基化表达差异也有统计学意义(p<0.05);癌旁组与正常组的甲基化率的差异也具有统计学意义(p<0.05)。支气管鳞状化生组织的甲基化阳性率为18%(2/11)，高于正常组(0%)，但两者相比差异不具有统计学意义(p>0.05)。P16基因的甲基化在肺癌患者吸烟组和非吸烟组中的差异也无统计学意义(P>0.05)。同时，pl6基因甲基化在不同组织分型，不同病理分级和不同临床分期中，差异也无统计学意义(P>0.05)。3.FHIT基因和pl6基因的MsP联合分析结果 本实验对两者在肺癌中的甲基化状态进行相关性分析，发现两者之间并无相关性。肺癌组FHIT、pl6基因甲基化的联合检测阳性率均显著高于单一检测一种基因的阳性率。吸烟患者的两种基因甲基化联合检测阳性率明显高于单一基因甲基化的检测，并且与非吸烟组相比较，差异具有统计学意义(p< 0.05)。4.基因测序结果 FHIT甲基化扩增产物中，所有的CpG岛中的胞嗜陡均保持不变，而CpG岛二核昔酸以外的胞啼咙经过PCR扩增后，则被胸腺喀睫取代。结论: 1.肺癌患者的FHIT基因5’一CpG岛发生了高频度的甲基化，表明其参与了肺癌 的演变，在肺癌的发展过程中可能是一个早期事件。FHIT基因甲基化率与肺癌 的组织分型、病理分级、临床分期无关。 2.p16基因5’一CpG岛甲基化与肺癌的发生密切相关，可能发生在肺癌形成的早 期阶段。p