糖尿病肾病（Diabetic kidney disease, DKD）是糖尿病最常见且最严重的并发症，是导致终末期肾衰竭的主要原因。近年研究表明，炎症在糖尿病肾病发病中具有重要作用。白介素1（Interleukin1, IL-1）家族细胞因子包括IL-1β、IL-18、IL-33等，是重要的促炎细胞因子，主要介导感染、应激、组织损伤等引起的免疫反应。研究发现，DKD患者肾间质中活性IL-1β、IL-18等促炎细胞因子明显增加，提示这些炎症细胞因子可能参与DKD的发生发展，但DKD时这些促炎细胞因子是如何产生并且活化的机制并不清楚。目前认为， IL-1家族细胞因子前体分子活化后才能发挥生物学效应，而这一活化过程必须依靠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）的剪切作用才能完成，NALP3（Cryopyrin）是NALP3炎性体最重要的的组成部分之一，属于NLRs （NOD like receptors, NLRs）家族成员，负责识别危险信号，活化Caspase-1，剪切IL-1家族前体，使之成为有活性的促炎细胞因子如IL-1β、 IL-18、 IL-33等，进而引起一系列的炎症反应。近年来NALP3在肾脏疾病中的病理生理作用已开始受到关注，研究发现小鼠肾脏缺血再灌注（I/R）模型中，NALP3^-/-和ASC^-/-小鼠肾组织炎症反应和肾功能损伤显著减轻，小鼠死亡率显著降低；在单侧输尿管梗阻模型中, NALP3炎性体活化与IL-1β产生增加相关，提示NALP3在非免疫因素介导的肾组织炎症反应中具有重要作用；最近研究发现，高糖诱导NALP3^-/-小鼠胰岛β细胞产生IL-1β显著降低，推测肾脏NALP3炎性体是否参与了高糖刺激肾小管上皮细胞产生IL-1β、IL-18等，进而引起肾间质炎症损害，而肾小管上皮细胞如何将高糖刺激信号传递到胞浆内进而激活NALP3炎性体尚不清楚。研究报道，ROS抑制剂APDC或NADPH氧化酶抑制物DIP均可抑制高糖激活胰岛β细胞NALP3炎性体及IL-1β的产生；格列本脲通过抑制细胞内K^＋外流而抑制高糖对NALP3炎性体的激活作用，提示氧应激和细胞内低钾可能是高糖激活胰岛β细胞NALP3炎性体的重要途径。P2Xs（Purinergic receptor X, P2Xs）是以核苷酸为激动剂的离子通道型嘌呤受体，当细胞外刺激信号（如ATP）作用于效应细胞时P2Xs发生构象变化，促进细胞外钙离子内流和钾离子外流，引起细胞内低钾；P2Xs还介导ATP引起的巨噬细胞ROS产生和IL-1β等炎症细胞因子释放，但目前未见高糖通过激活P2Xs活化NALP3的文献报道。由于P2Xs激活的下游事件如细胞内低钾和ROS增多，均是NALP3炎性体活化途径中的重要环节，并且P2Xs的重要成员P2X4在肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞都有表达，此外，高糖负荷和ATP可上调系膜细胞P2X4表达参与糖尿病肾病肾小球硬化的发生，因此我们推测，肾小管上皮细胞可能通过P2X4感受高糖信号的刺激而激活NALP3炎性体，促进活性IL-1β和IL-18等的产生，进而引起肾小管间质炎症反应，放大高糖引起的炎症反应瀑布，最终导致糖尿病肾病肾间质炎症反应。为此，本课题针对DKD患者肾小管上皮细胞P2X4、NALP3、 IL-1β、 IL-18的表达规律及其变化关系进行了研究，为下一步研究其机制奠定理论基础，旨在为揭示糖尿病肾病肾小管间质炎症反应的机制提供新的科学依据。一、实验方法1.研究对象及分组根据1999年WHO、IDF公布的糖尿病以及Mogensen糖尿病肾病诊断标准[1]，选取2010年9月至2011年10月第三军医大学大坪医院肾脏内科收治的经临床和肾活检确诊为2型糖尿病肾病病例30例（尿蛋白>500mg/d或SCr>120μmol/L），其中男性12例，女性18例，年龄40-68岁，（平均47.93±7.05岁）；对照组为泌尿外科肾脏错构瘤切除术或肾移植术病例（尿蛋白<500mg/d或SCr <120μmol/L）10例，其中男性6例，女性4例，年龄40-65岁，（平均50.60±9.40岁），并留取肾错构瘤切除后或肾移植术后经病理诊断为正常的肾组织。所有对象均排除糖代谢异常、吸烟、高血压、肥胖等干扰因素。收集标本时均取得患者本人及家属的知情同意，所选患者均排除糖尿病急性并发症、泌尿系感染、严重心、肝、肾功能不全、以及风湿病、恶性肿瘤等系统性疾病。2.检测指标及方法于术前收集对照组患者血、尿标本，肾活检前一天收集DKD患者的血、尿标本，常规生化方法检测血清总胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白胆固醇（LDL）、空腹血糖、24小时尿蛋白定量、血清肌酐（SCr），测量收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、计算体重指数（BMI）、估算肾小球滤过率（eGFR），按照Cockcroft-Gault计算公式： eGFR （mL/min per1.73m2）=（140﹣age）×BW（kg）/[72×Scr （mg/dl）]×0.85（if female）；免疫组化方法检测对照组及DKD组肾小管上皮细胞P2X4、NALP3、IL-1β及IL-18的表达变化规律；激光共聚焦技术检测P2X4、NALP3、IL-1β及IL-18的表达变化关系；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测两组患者尿液中IL-1β、IL-18的水平。二、实验结果1.一般情况与对照组相比，DKD组患者24小时尿微量白蛋白、空腹血糖、SBP、DBP、总胆固醇、LDL胆固醇、甘油三酯及BMI显著增高（P<0.05），eGFR显著降低（P<0.05）。2. NALP3、 IL-1β、 IL-18在肾小管上皮细胞的表达情况及其与肾间质损伤的相关性免疫组化结果显示对照组肾小管上皮细胞胞浆NALP3呈低水平的表达，IL-1β、IL-18基本不表达；DKD组患者肾小管上皮细胞胞浆NALP3、IL-1β、 IL-18表达显著增加（P<0.05）；相关分析表明： DKD患者肾小管上皮细胞NALP3、IL-1β、IL-18表达与肾间质炎症呈显著正相关关系（r=0.66,r=0.55, r=0.83, P<0.01）、与肾间质纤维化呈显著正相关关系（r=0.65, r=0.50, r=0.81, P<0.01）、与肾小管萎缩呈显著正相关关系（r=0.63, r=0.56,r=0.82, P<0.01），与eGFR呈显著负相关关系（r=-0.73, r=-0.65, r=-0.58,P<0.01）；激光共聚焦结果显示DKD组患者NALP3与IL-1β、IL-18分别共表达于肾小管上皮细胞胞浆。3. P2X4在肾小管上皮细胞的表达情况及其与肾间质损伤的相关性免疫组化结果显示对照组肾小管上皮细胞胞浆P2X4呈低水平的表达，DKD组患者肾小管上皮细胞胞浆P2X4表达显著增加（P<0.05）；相关分析表明：DKD患者肾小管上皮细胞P2X4与肾间质炎症呈显著正相关关系（r=0.82, P<0.01），与肾间质纤维化呈显著正相关关系（r=0.80, P<0.01），与肾小管萎缩呈显著正相关关系（r=0.80, P<0.01），与eGFR呈显著负相关关系（r=-0.58, P<0.01）；激光共聚焦结果显示DKD组患者P2X4与NALP3、IL-1β、 IL-18分别共表达于肾小管上皮细胞胞浆。4. ELISA检测尿中IL-1β、 IL-18水平变化结果显示，DKD患者尿IL-1β、IL-18水平较对照组显著增高（P<0.05）。三、结论1. DKD患者肾小管上皮细胞P2X4、 NALP3、 IL-1β、 IL-18表达与肾间质损伤及肾功能改变的相关性表明肾间质炎症反应可能影响肾脏功能的减退，导致DKD向ESRD方向发展。2. DKD患者肾小管上皮细胞P2X4、 NALP3、 IL-1β、 IL-18之间的共表达提示DKD时，P2X4、NALP3可能通过促进肾间质炎症反应，从而加速糖尿病肾病的进展。