右旋糖酐定量检测试剂盒的研制及其初步应用

来源 :厦门大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lishuangjie2009
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右旋糖酐(Dextran),又名葡聚糖,由Leuconostoc mesenteroides等微生物产生的酶聚合葡萄糖而成或葡萄糖通过化学聚合而成。右旋糖酐广泛应用于医药、食品、化工等领域。在医学领域的应用主要包括:作为血浆体积扩张剂,作为抗凝剂,以及作为渗透压调节剂用于相关的疾病治疗。一般机体组织细胞并不能直接利用右旋糖酐,主要从尿液排出,右旋糖酐使用过量会引起急性肾衰竭、充血性心衰竭、肺水肿及血小板减少等毒副作用。因此,监测血液、尿液的右旋糖酐含量是指导右旋糖酐用量的重要指标,同时右旋糖酐也是诊断血液或尿道微生物感染的依据,另外右旋糖酐的定量监测也是食品工业质控的一个重要指标与技术。本论文研究利用抗右旋糖酐单克隆抗体建立简便、快速的右旋糖酐竞争ELISA定量检测试剂盒。  首先,利用右旋糖酐与BSA交联物作为免疫原,免疫4~6周龄雌性BALB/c小鼠,通过细胞融合技术筛选获得3株(命名为D9,D24,D27)稳定分泌抗右旋糖酐单克隆抗体杂交瘤细胞株。腹腔注射D24杂交瘤细胞制备腹水,经rProtein A亲和柱纯化得到了纯度较高的抗体(抗体纯度约为95%,浓度约为2 mg/mL);间接ELISA结果表明抗体效价达到2.5×10-5,表明抗体具有较高的特异性和亲和力。  其次,利用抗右旋糖酐单克隆抗体建立右旋糖酐竞争ELISA定量检测方法,确定检测体系优化条件:(1)抗原包被浓度为1.25 tg/mL;(2)包被时间为4℃过夜;(3)封闭液为2% BSA;(4)右旋糖酐单克隆抗体稀释度为1:8000;(5)竞争反应时间为37℃,1 h;(6)底物作用时间为10 min。该优化检测体系对dextran2000标准品在浓度19.53 ng/mL~1250 ng/mL范围内线性关系良好,相关系数R2=0.9964;体系最低检测限为9.6 ng/mL;标准品回收率在90.7%~115.6%之间;批内、批间变异系数均小于15%,表明该检测方法具有良好的灵敏度和较高的准确性。  最后,利用建立的定量检测方法测定临床样品,结果表明,45份人血清和尿液样品中,29份未检出右旋糖酐(<9.6 ng/mL);有16份可检出右旋糖酐(范围:10.0±1.2 ng/mL~22.2±2.8 ng/mL),其中有2份尿液样品出现较高浓度右旋糖酐,比一般尿液右旋糖酐检出均值(14.3 ng/mL)高5倍以上,提示这两份样品可能受到微生物的感染,与临床诊断尿路感染相符。竞争ELISA测定的结果与双抗体夹心ELISA法测定的结果相似,进一步证实竞争ELISA在临床上测定右旋糖酐含量的可行性。
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