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寒冷是严重影响植物生长和发育的一种非生物胁迫,是全球作物产量的主要限制因素。为了克服由胁迫而引起的作物产量损失,必须开发耐胁迫的作物栽培品种。植物通过复杂的生理和生化过程响应或适应寒冷胁迫,包括改变基因表达水平,信号传导途径和细胞代谢速率,从而获得抗性。目前,科研人员已经进行了大量的研究来探究植物冷响应的应对机制和调节网络。对植物lncRNAs的研究表明,lncRNAs已经成为了一类重要的调节因子,它们几乎在所有的植物发育过程中都起着关键作用,并且通过许多复杂的机制参与基因表达的转录和转录后调控。本研究中,我们使用链特异性RNA测序(ssRNA-seq)的方法来研究以高通量方式受低温胁迫攻击的木薯的全基因组表达水平。特别关注了由筛选得到的与冷害有关的lncRNA-CRR1表现出的对应激反应的表达模式,并且对lncRNA-CRR1进行了功能研究。具体的研究结果如下所示:1.通过改进后的RNA-seq测序方法,我们从RNA-seq数据库中总共鉴定得到318个响应冷胁迫和干旱的lncRNAs。通过进一步的分析得到了 198个冷特异性差异表达的 DE-lncRNAs(Differentially Expressed-lncRNAs)。最后结合生物信息学分析,重点筛选出受低温调控的lncRNA-CRR1。其中lncRNA-CRR1的全长为976 bp,含有3个外显子,染色体位置在Chromosome 01:26346926-26350713,负链表达。2.通过NCBI网站上提供的BLAST序列比对,对lncRNA-CRR1进行同源性分析。最终发现本研究中的CRR1与木薯中的组氨酸酰化转移酶的相似度在90%以上,此外,CRR1和木薯中一种未知的mRNA的同源性最为接近。与此同时,我们对CRR1的碱基对进行二级结构特征的分析,结果发现CRR1的二级结构是多环发夹结构,茎环数较多,说明CRR1易与RNA分子、蛋白质等结合,结构并不稳定,保守性也不高。我们将木薯中的lncRNA-CRR1与拟南芥等植物中耐低温的lncRNA的茎环数和保守性进行对比分析,从而探究其功能。3.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析结果显示:对木薯组培苗低温处理不同的时间后,发现CRR1的相对表达量呈现出先上升后下降的趋势,尤其是在低温处理24h后,差异表达最明显,相对表达量约为对照组的20倍。这说明了木薯中lncRNA-CRR1对低温胁迫有响应,在低温处理24h后的相对表达量更是达到了峰值。4.Southern杂交分析结果显示lncRNA-CRR1已经成功的转入到木薯转基因株系OE-1和OE-5的基因组中,并且以单拷贝的形式整合到木薯受体细胞的染色体内。实时荧光定量PCR则显示大部分转基因株系中lncRNA-CRR1的相对表达量比野生型的高很多,说明lncRNA-CRR1过表达。5.在对木薯野生型和转基因株系进行低温4℃处理24h后,通过表型观察发现:转基因木薯株系OE-1和OE-5在低温处理前后表型并无明显变化,而野生型木薯在低温处理后叶子出现萎蔫和皱缩。说明转基因木薯的抗寒能力比野生型木薯强,在低温诱导下,lncRNA-CRR1会对胁迫作出应激反应。6.对木薯转基因株系OE-1、OE-5以及野生型WT低温处理前后四种生理指标进行测定,包括可溶性糖含量、MDA含量、脯氨酸含量以及过氧化氢含量。结果指出,转基因株系与野生型相比,可溶性糖、脯氨酸以及过氧化氢含量显著增加而MDA的含量则减少,说明转基因株系的抗寒性较强;此外,在转基因株系之间的比较发现:在低温处理前后,OE-5中可溶性糖、脯氨酸以及过氧化氢含量增加的幅度比OE-1明显,而MDA的含量又较低,说明OE-5的抗寒能力比OE-1的抗寒能力高。7.通过共表达基因分析来鉴定lncRNA的网络调节,从而进一步了解其功能。结果表明,总共有12651个蛋白质编码基因与冷响应lncRNA共表达,其中筛选得到与lncRNA-CRR1有关的16个共表达基因,共表达系数都在0.95以上,说明可信度较高,且均呈现出正相关的表达模式。研究发现WRKYDNA结合域和碱性的亮氨酸拉链(bZIP)转录因子均受低温诱导,因此我们预测lncRNA-CRR1也受到了冷害的调控,在低温下显著差异表达,可用于进一步的功能验证。8.通过对转基因株系OE-1和OE-5中lncRNA-CRR1相关差异表达靶基因进行KEGG途径富集分析,结果表明:OE-1中,在显著差异表达的lncRNA中发现响应于冷胁迫的20个途径。其中,最丰富的途径包括转录调控的次生代谢物的生物合成和代谢途径;OE-5中,在显著差异表达的lncRNA中发现响应于冷胁迫的20个途径。其中,最丰富的途径包括转录调控的次生代谢物的生物合成和代谢途径以及糖代谢,氨基糖和核苷酸糖代谢,还有次生代谢物的生物合成和代谢途径。这些结果显示lncRNA-CRR1的主要作用可能是与基因表达的转录调控有关,尤其是参与激素信号传导和次级代谢途径的基因。