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1. 霍乱毒素B亚基在家蚕杆状病毒表达系统的表达与活性分析 霍乱毒素B亚基(cholera toxin B submit,CTB)是霍乱毒素的无毒单位,具有很强的免疫原性,能刺激机体产生黏膜IgA和血清IgG抗体。B亚单位的主要功能是与有核细胞上的GM1-神经结苷脂结合而使得A亚单位进入细胞,这个功能使它在免疫佐剂、口服疫苗与多肽衍生疫苗的研究中具有越来越重要的作用。 在本论文中,霍乱毒素B亚单位与多角体蛋白的融合基因被克隆至昆虫杆状病毒表达载体系统(BEVS)的转移载体pBacPAK8中,使其置于多角体蛋白(polyhedrin)基因启动子控制之下,获得重组转移载体pBacPAK-mCTB。重组转移载体DNA与经Bsu36I酶切线性化的修饰型病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,然后经空斑纯化、PCR扩增、Southern杂交等方法鉴定出含CTB基因的重组病毒BacPAK-mCTB。将重组病毒BacPAK-mCTB感染BmN细胞及五龄幼虫, SDS-PAGE电泳分析显示重组杆状病毒的116kD的β-半乳糖苷酶条带缺失,证实外源基因已成功取代了LacZ基因:Western blotting分析发现在14kD及70kD处有分别都有明显条带。其表达的融合蛋白产物经ELISA检测显示细胞和虫体表达分别为5.6μg/ml54.4μg/ml.在蚕体中得到了高效表达:而GM1-ELISA说明CTB五聚体的结合GM1-神经结苷脂的生物学功能。NOD小鼠的免疫增强实验则明显的反映了CTB的免疫试剂及佐剂功能:它能显著增强胰岛素对自身免疫疾病的治疗效果,本实验诱导免疫耐受的较佳组合为混合的100μg胰岛素和10μg CTB含量的蚕血;而且单独喂养CTB的NOD小鼠也显示出良好的免疫增强作用,能够延缓NOD小鼠的糖尿病发作,制止进～步的胰岛的恶化。2. 小麦小孢子特异表达β-expansin基因TaEXPB2的克隆与表达 Expansin是一种体外诱导分离的植物细胞壁伸展的蛋白,在修饰细胞壁基础上使细胞膨胀。Expansin的功能众多,除了细胞生长,还包括营养生长、形态发生、授粉受精、果实软化等,并表现出高度组织、器官和细胞特异性。 本论文在小麦小孢子特异表达阶段,经基因组DNA提取、RT-PCR、Northern及Southern技术,首次鉴定出了一个小麦小孢子特异β-expansin cDNA-TaEXPB2