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背景:肿瘤转移是肿瘤治疗中亟待解决的问题。近年来的研究表明,当肿瘤处于癌前病变的时期,肿瘤细胞已经出现循环系统的播散,部分肿瘤细胞可在适宜的环境下定植形成微小的转移灶。因此,早期诊断肿瘤,早期接受有效的治疗,可明显改善患者预后,延长患者生存期。目前研究认为,肿瘤复发的关键因素在于循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs)潜在的侵袭能力。CTCs在参与肿瘤转移过程中,相关的过程被称之为上皮间质转化,即肿瘤上皮细胞发生相应变化,使肿瘤细胞之间的结合力减弱,这增强了肿瘤的迁移力和浸润能力,使其从原发灶脱落,发展成为远处转移。CTCs携带原发肿瘤相关的信息,可作为“液体活检”,且检查方法方便、创伤小且安全,更能够真实的反映肿瘤的生物学特征,在肿瘤的诊疗过程中起重要作用。CTCs检测可作为“液态活检”,在肿瘤早期进行检测、指导辅助治疗,从而达到肿瘤个体化治疗的目的。CTCs检测阳性常常提示出现远处转移或微转移,因此CTCs检测可对肿瘤进行早期检测早期预防。与此同时,CTCs还能够提供肿瘤的相关生物学信息,实时监测患者病情,从而达到延长生存期改善患者生活治疗的目的。相关研究发现,CTCs计数在非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌等恶性肿瘤中有良好的应用,可有效对疾病预后进行评估。目的:本文将建立一种有效的检测外周血循环肿瘤细胞的方法,该方法富集系统联合应用梯度密度离心法和免疫磁珠法,并将其应用与临床实验,动态监测中晚期肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)及结直肠癌肝转移(Colorectal cancer liver metastases,CRLM)患者冷冻消融术后循环肿瘤细胞的变化,对冷冻消融术进行疗效评价及对患者行生存分析。方法:1、将不同数量、不同细胞株混入健康人学标本中以模拟肿瘤患者的血样,对该血样进行富集检测,计算掺入细胞实验肿瘤细胞的回收率以验证其方法的有效性。2、采用上述方法联合应用实时定量pcr法监测47例中晚期肝细胞癌及55位结直肠癌肝转移患者冷冻治疗前后外周血ctcs动态变化水平,并对患者行生存分析。结果:1、不同细胞株随着肿瘤细胞浓度的增加,检测到的ctcs数量也随之增加,相关性最好的肝细胞癌细胞株和结直肠癌细胞株为hepg2和cx-1,具有显著相关性。2、将hepg2、cx-1细胞掺入健康志愿者外周血形成梯度稀释,以验证本方法ctcs的回收率,回收的细胞与添加细胞间数量有显著相关性。3、47例中晚期hcc患者冷冻消融术术后7天、30天的与术前的基线相比,ctcs数目明显减少(p<0.01)。4、47例中晚期hcc患者冷冻治疗后的ctcs标志物的ct值均升高,2-ct值均小于1,表明冷冻冷冻治疗后肿瘤标记物表达不同程度的减少。统计学分析显示数据有显著统计学意义(p<0.01),5、47例中晚期hcc患者接受冷冻消融术后,kaplan-meier生存分析表明,ctcs升高组患者术后生存期显著短于ctcs降低组(p<0.05)6、55例crlm患者冷冻消融术术后7天、30天的与术前的基线相比,ctcs数目明显减少(p<0.01)。7、55例crlm患者冷冻治疗后的ctcs标志物的ct值均升高,2-ct值均小于1,表明冷冻冷冻治疗后肿瘤标记物表达不同程度的减少。统计学分析显示数据有显著统计学意义(p<0.01)8、55例crlm患者接受冷冻消融术后,kaplan-meier生存分析表明,ctcs升高组患者术后生存期显著短于ctcs降低组(p<0.05)结论:1、CTCs富集检测方法可有效且敏感的从肿瘤患者外周血细胞中检测出CTCs2、冷冻消融术后CTCs数目明显减少、相关肿瘤标志物mRNA表达水平降低3、CTCs数目降低的患者较CTCs数目升高的患者生存期长。