研究背景癌症严重威胁人类健康,除手术治疗外,化学治疗仍然是肿瘤治疗的主要手段。目前临床广泛应用的化疗药物除传统的细胞毒类药物外,单克隆抗体、小分子化合物抑制剂等靶向药物越来越受到重视,并已经是目前及未来相当长时间内引领化疗领域发展动向的主要研究方向。尽管如此,这些药物仍然存在一定的毒副作用,并产生耐药性,这可能是限制药物成功化疗的主要因素。为克服这些弱点,我们拟对细胞毒类药物吉西他滨进行前体药物修饰,对小分子靶向抑制剂索拉非尼进行结构改造。吉西他滨以抗癌活性强、抗瘤谱广的特点在化疗药物中占居重要地位,但其在血浆和肝脏中很快被灭活,且严重的毒副作用和耐药性也限制其临床应用。我们认为,对吉西他滨进行前药修饰,在胞啶环的N4位引入具有长侧链酯基酰胺基团,在一定程度上可以增加胃肠道吸收,阻断脱氧胞苷脱氨酶的脱氨作用,增强代谢稳定性,延长半衰期,提高生物利用度,从而达到增加抗癌活性,降低毒副作用的目的。我们从此系列化合物中筛选得到了SL-01(N4-(3-正十二烷氧基甲酰基吡嗪-2-甲酰基)-2’-脱氧-2’,2’-二氟胞苷),发现其具有较高的抗癌活性。本论文第一部分重点评价了化合物SL-01的抗肿瘤活性并对其作用机制进行初步探讨。首个口服多激酶抑制剂索拉非尼是化疗药物中比较成功的双芳基脲类化合物,但毒副作用以及易产生耐药性也是其临床应用所不可忽视的。根据索拉非尼的结构特点,我们设计合成了一系列基于吲唑或氮杂吲唑的双芳基脲类或硫脲类化合物,初步试验显示出较好的抑制肿瘤细胞增殖的活性。本论文的第二部分对初步筛选得到的15个化合物的体外抗肿瘤活性进行了进一步的筛选,对筛选出的化合物1082-39(N-{4-[1-(4-溴吲唑)]苯基}-N’-[4-氯-3-三氟甲基苯基]脲),探讨其对人黑色素瘤M21体外抗癌活性和作用机制。第一部分吉西他滨口服衍生物SL-01的抗癌活性研究实验目的：比较评价化合物SL-01与吉西他滨的抗肿瘤活性,初步探讨SL-01的抗癌作用机制。实验方法：选用人非小细胞肺癌细胞NCI-H460和人结肠癌细胞HCT-116,以MTT法检测了SL-01对癌细胞增殖的抑制作用,Hochest33258染色法和流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染实验测定了SL-01对癌细胞凋亡诱导作用；体内实验,通过建立裸鼠移植NCI-H460和HCT-116肿瘤模型,检测了SL-01对NCI-H460和HCT-116肿瘤细胞生长的抑制作用,进一步以TUNEL法检测了SL-01诱导肿瘤细胞凋亡率,western blotting法检测了SL-01对肿瘤组织caspase-9、caspase3、PARP、 Bax和Bcl-2的调控作用。实验结果：SL-01(0.156-20μM)与NCI-H460和HCT-116细胞分别孵育24h,48h,72h, SL-01以时间和剂量依赖性方式,显著抑制癌细胞增殖；相同剂量下SL-01与吉西他滨对癌细胞的体外抑制活性相似。以8μM SL-01和吉西他滨分别处理细胞24h,Hoehest33258染色,可见细胞核染色质固缩浓染、或集聚至核膜周边、或出现碎裂呈珠串状等典型凋亡现象。FITC-Annexin V/PI双染结果显示,SL-01明显诱导细胞凋亡,8μM的SL-01作用24h,诱导NCI-H460和HCT-116细胞凋亡率分别为39.6%和41.4%,高于相同剂量下吉西他滨的凋亡活性(NCI-H460:27.8%,HCT-116:24.6%),裸鼠实验表明,口服给予SL-01(10、20、30、μmol/kg,三天一次)三周,可明显抑制NCI-H460和HCT-116肿瘤生长,抑制率分别为31.8%、43.1%、58.0%和36.4%、45.8%、63.1%,且对裸鼠体重影响不甚明显；静脉注射给予同剂量吉西他滨(30μmol/kg,三天一次)对NCI-H460和HCT-116肿瘤生长的抑制率分别是41.5%和46.9%,但动物体重下降较明显。对肿瘤组织进行TUNEL分析,显示SL-01处理组(10、20、30μmol/kg)肿瘤组织中TUNEL阳染率明显增高,NCI-H460和HCT-116组织中TUNEL阳染率分别为25.6%、41.7%、54.3%和20.7%、33.6%、47.7%,吉西他滨处理的NCI-H460和HCT-116组织中阳染率则分别为37.2%和31.2%。Western blotting实验发现,SL-01对肿瘤组织caspase-9、 caspase3和PARP裂解活化程度及对Bax/Bcl-2上调作用均明显高于吉西他滨。实验结论：SL-01对NCI-H460和HCT-116细胞的体外增殖抑制作用与吉西他滨相似,但对裸鼠接种的人癌细胞生长抑制作用明显优于吉西他滨。SL-01的抗癌活性与其诱导凋亡作用有关,符合caspase依赖性凋亡诱导作用机制。第二部分吲唑双芳基脲类化合物的抗癌活性研究第一节吲唑双芳基脲类化合物抗癌活性筛选实验(体外实验)实验目的：对新设计的15个基于吲唑或氮杂吲唑的双芳基脲类或硫脲类化合物筛选,初步评价筛选出的5个化合物对血管生成的抑制作用和对黑色素瘤细胞M21增殖的抑制作用。实验方法：采用MTT法,检测了1121-39等15个双芳基脲类化合物对人肿瘤细胞MDA-MB-231、PLC/PRF/5、HCT-116、786-0、NCI-H460生长的抑制作用;化合物1121-39、1122-10、1122-38、1122-37和1082-39对人黑色素瘤细胞M21及人脐静脉内皮细胞HUVEC和EA.hy926生长抑制作用；利用划痕损伤法,检测化合物1121-39、1122-38和1082-39对HUVEC细胞迁移能力的影响；以斑马鱼胚胎模型法,检测化合物1121-39、1122-10、1122-38、1122-37和1082-39对血管生成的影响。实验结果：结果显示,除化合物1121-43、1122-26、1121-40外,新合成的其他化合物与MDA-MB-231、PLC/PRF/5、HCT-116和NCI-H460细胞分别孵育72h,其IC50值多低于索拉非尼,而对于786-0细胞,只有1122-38、1082-39、1122-37、1104-40和1106-78的IC50值小于索拉非尼。筛选出的化合物1121-39、1122-10、1122-38、1122-37和1082-39与EA-hy-926细胞作用72h,其IC50值远低于索拉非尼;而对于HUVEC细胞,只有化合物1121-39的IC50值为4.81±1.97μM；对于M21细胞,化合物1122-38和1082-39作用72h的IC5o值远低于索拉非尼,1122-10和1122-37的IC50值与索拉非尼相当,而1121-39对M21细胞增殖无明显抑制作用。划痕实验显示,化合物1121-39、1122-38和1082-39能抑制HUVEC细胞迁移作用,以5μM作用24h,对HUVEC的迁移抑制率分别为23.16%、41.32%和45.63%,明显低于相同剂量下的索拉非尼的抑制率71.85%。斑马鱼胚胎模型显示,阳性对照药物索拉非尼显著抑制斑马鱼胚胎体节间血管形成,致血流停滞和不同程度心囊水肿,循环系统障碍,而化合物1121-39、1122-10、1122-38、1122-37和1082-39对斑马鱼胚胎体节间的血管生成无明显影响,未见血流异常等现象。实验结论：筛选获得到的吲唑双芳基脲类化合物1121-39、1122-10、1122-38、1122-37和1082-39,体外对多种人癌细胞的增殖有明显抑制作用,且活性优于索拉非尼,但对斑马鱼胚胎血管生成没有影响。第二节化合物1082-39体外抗肿瘤活性研究及其机制探讨实验目的：比较评价化合物1082-39和索拉非尼对人黑色素瘤M21的抗癌活性,探讨1082-39的抗癌作用机制。实验方法：采用MTT法,测定了化合物1082-39和索拉非尼对人黑色素瘤细胞M21作用24、48、72h的半数抑制率。以流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测了1082-39与M21细胞孵育48h后的凋亡诱导作用。采用JC-1染色法,观察了不同浓度1082-39作用48h,对M21线粒体膜电位的影响。提取M21细胞总蛋白,以western-blotting法检测了M21细胞受体c-Kit表达水平,检测了1082-39作用48h对M21细胞增殖核抗原PCNA,caspase-9、caspase3、PARP、Bax、Bcl-2、 Mc1-1等凋亡相关蛋白、Akt及相关信号NF-κB、mTOR、GSK3β、c-Myc、survivin、 PI3K、EGFR、Wnt2表达水平的影响；分别分离提取线粒体蛋白及核蛋白,采用western-blotting法检测了1082-39对M21细胞色素c的重新分布及P-catenin入核的影响。实验结果：化合物1082-39与M21细胞分别孵育24、48、72h,其IC50值均明显低于索拉非尼,以72h最为明显。流式细胞术显示,1082-39明显引起M21细胞凋亡,作用48h后,其5μM组凋亡率40.73%,高于同剂量索拉非尼的凋亡率25.26%。以0、0.625、1.25、2.5、5μM的1082-39处理细胞48h,JC-1染色为红色荧光逐渐减弱,绿色荧光逐渐增强,绿色与红色荧光光密度比值增加,最高组为2.71±0.2,高于索拉非尼组的光密度值之比(2.13±0.6)。Western blotting结果显示,与细胞孵育48h,1082-39比索拉非尼明显下调M21细胞中PCNA表达量；1082-39显著上调Bax表达,下调Mcl-1表达,而索拉非尼则引起Mcl-1表达量明显下调,但对Bax和Bcl-2表达影响较弱,二者均能上调Bax/Bcl-2,Bax/Mcl-1值,引起细胞色素c由线粒体到胞浆重新分布；对于凋亡执行蛋白,1082-39可以明显促进casepase-9和casepase-3裂解活化,PARP裂解增加,而索拉非尼对casepase-9和casepase-3活化作用较弱；Western blotting结果显示,M21细胞中无受体c-Kit表达,但1082-39与索拉非尼均能抑制Akt磷酸化活化,并抑制其上游蛋白PI3K、EGFR、Wnt2及下游蛋白NF-κB、mTOR、GSK3β、c-Myc、survivin表达或活化,且以1082-39作用更为明显。实验结论：1082-39具有比索拉非尼更好的抑制M21细胞增殖活性,诱导M21凋亡作用,其机制可能与调节Akt信号通路有关。