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目的:探讨烧伤患者皮肤来源成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞(i PSCs)的可行性与方法,为个体特异性i PSCs在皮肤组织工程构建和创面与瘢痕修复中的应用奠定基础。方法:(1)取烧伤患者植皮手术剩余皮片,应用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮和真皮,采用组织块贴壁法对真皮组织进行培养。待原代培养的成纤维细胞基本长满瓶底后,进行传代培养,按常规进行传代、冻存、复苏。实验用细胞为传代3至5代。(2)将携OCT4、SOX2、NANOG转录因子的非整合仙台病毒载体,转染上述体外培养的烧伤患者皮肤成纤维细胞。并在高糖DMEM+FBS培养条件下进行培养。通过手动挑取克隆方式,将克隆团块转移至Matrigel包被好的培养皿中用于进一步的扩增和分析。(3)收集细胞克隆行碱性磷酸酶染色及免疫荧光染色,检测细胞干性及胚胎干细胞标志物OCT4、SOX2、NANOG、TRA-160、TRA-181和SSEA4表达。采用传代至16代的i PSCs行染色体核型分析。将重编程得到的i PSCs体外悬浮与贴壁培养后,采用PCR检测相关基因的表达。将重编程得到的i PSCs注射到4周龄NOD-SCID雄鼠体内后有瘤体形成,并对瘤体采用HE染色检测相关基因的表达。使用试剂盒对重编程后细胞的OCT4和NANOG启动子区域甲基化水平进行检测。结果:(1)经过对真皮组织块培养,培养11天时发现有细胞从组织块周边长出,细胞呈现出典型的分支状和梭形;经过24天的培养,当细胞汇合度达到90%时,对其进行传代。取第三代细胞检测成纤维细胞表面标记分子波形蛋白的表达,发现其表达结果为阳性。结果表明,本实验成功从烧伤患者皮肤组织中培养出了成纤维细胞。(2)转染后第8天,在荧光倒置显微镜下观察发现散在分布的形态类似胚胎干细胞的克隆团块。转染后3-4周,克隆团块体积变大,核浆比大,细胞彼此融合。AP结果表明,我们获得了干细胞。免疫荧光染色显示,胚胎干细胞标志物OCT4、SOX2、NANOG、TRA-160、TRA-181、SSEA4表达均呈阳性。染色体核型分析结果显示人诱导多能干细胞二倍体染色体的数目为2N=46,XY,Video Tes T-Karyo 3.1软件排序分析结果表明染色体正常。(3)重编程得到的i PSCs在体外培养分化形成拟胚体(Embryoid Body,EB)。PCR检测显示i PSCs中OCT4基因表达阳性,而在EB细胞中GATA4、SOX1、MSX1表达阳性,证实重编程得到的i PSCs在体外培养条件下具有分化成三个胚层的能力。重编程得到的i PSCs注入小鼠体内后形成畸胎瘤。HE染色结果显示有来自于内胚层的腺体组织,中胚层的肌肉组织,外胚层的神经组织,证实重编程得到的i PSCs在体内条件下具有分化成三个胚层的能力。OCT4和NANOG的启动子区域甲基化状态检测显示,i PSCs中这两个干性标志基因呈现高度的去甲基化。结论:本课题采用组织块贴壁法获得了烧伤患者皮肤来源的成纤维细胞。采用不干扰基因组功能的非整合仙台病毒载体转染烧伤患者皮肤来源成纤维细胞,可以成功构建烧伤患者个体特异性i PSCs,其在克隆形态、生长特性、表面标志物、基因表达模式及体内外分化等方面与胚胎干细胞非常相似,有望为其在皮肤组织工程构建和创面与瘢痕修复中的应用提供广阔的供体细胞来源。