论文部分内容阅读
食管癌(Esophageal cancer,EC)是威胁人类生命安全的主要癌症之一。在亚洲的部分国家以及一些低收入国家如南非等,食管癌都严重影响了人们的生命。食管癌的主要病理分型为食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(Esophageal adenocarcinoma,EAC)。在中国地区,食管鳞癌的发病率占食管癌发病率的90%以上,尤其是一些平原地区,如河南,河北。由于缺乏有效的早期诊断,食管癌诊断往往都处于中晚期,导致预后不良。目前手术仍然是治疗食管癌的主要方式,但是术后复发率很高。研究表明,手术后应用化学预防药物可以很好的预防肿瘤的复发,因此亟需发现低毒高效的药物来延缓食管癌的复发,提升患者的生存率。本课题组筛选了从中药中提取的天然化合物,发现柳穿鱼黄素能有效抑制食管鳞癌细胞的增殖。柳穿鱼黄素是一种黄酮类化合物,有研究表明它可以抑制多种肿瘤的生长,包括肺癌,胃癌等,作用机制仍不明确。我们首先用细胞增殖实验以及软琼脂克隆,平板克隆等实验方法证实了柳穿鱼黄素对于食管鳞癌的增殖抑制作用。为了更好的研究它抑制食管鳞癌的作用机制,运用蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学的数据分析方法,结果表明柳穿鱼黄素可以显著抑制食管鳞癌细胞中 pYAPs109、pSTAT3Y705、pNFKBS907、pMAPK3T202、pGSK-3BY216和pRB1T826磷酸化水平,这些结果与之前报道的相关研究结果部分一致。我们发现了 CDK6/CCND1-RB1通路中的pRBlT826磷酸化水平的降低。Pull down实验表明柳穿鱼黄素可能直接与CDK6蛋白激酶结合。体外激酶实验的结果表明,柳穿鱼黄素能够抑制CDK6对pRBlT826的磷酸化。为了评估柳穿鱼黄素对于食管鳞癌的增殖抑制作用,我们建立了食管鳞癌的人源化移植瘤(Patient-derived xenograft,PDX)模型,发现柳穿鱼黄素能够在体内抑制食管鳞癌的增殖,免疫组织化学染色结果表明柳穿鱼黄素可以在体内降低pRB1T826的水平。综上所述,本课题研究发现,柳穿鱼黄素通过抑制病毒致癌通路、霍乱弧菌感染通路、催乳素信号通路和T细胞受体信号通路等多条通路中的pYAPS109、pSTAT3Y705、pNFKBS907、pMAPK3T202、pGSK-3BY216 和 pRB1T826 等蛋白的表达来抑制食管鳞癌的增殖。进一步研究结果表明,柳穿鱼黄素可能直接与CDK6结合从而抑制CDK6蛋白激酶对于RB1的激活作用,降低pRB1T826的磷酸化水平,从体内以及体外两方面对食管鳞癌产生抑制作用。该研究结果为,柳穿鱼黄素可以靶向CDK6,抑制pRB1T826的磷酸化,从而发挥抑制食管癌的作用。实验方法和目的1.细胞的毒性实验:该实验用于研究柳穿鱼黄素对于食管鳞癌细胞有无毒作用。2.细胞的增殖实验:该实验用于检测柳穿鱼黄素对于食管鳞癌细胞的增殖抑制作用。3.软琼脂克隆形成实验:该实验用于模拟并研究柳穿鱼黄素对食管鳞癌细胞克隆形成能力的作用。4.平板克隆形成实验:该实验进一步证实柳穿鱼黄素抑制食管鳞癌细胞克隆形成的能力。5.蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学实验:分析柳穿鱼黄素作用于食管鳞癌细胞后,细胞内部的蛋白以及磷酸化蛋白水平的变化。6.蛋白免疫印迹实验:为了验证蛋白组学以及磷酸化蛋白组学结果中的差异蛋白表达量是否改变,以及通路相关蛋白的表达水平。7.分子下拉实验与计算机分子模拟对接实验:为了验证柳穿鱼黄素是否可以与CDK6分子直接结合。8.体外激酶实验:验证CDK6是否可以在Tyr826位点上磷酸化激活RB1蛋白以及柳穿鱼黄素是否可以抑制CDK6对RB1的激活作用。9.PDX模型:在体内检测柳穿鱼黄素抑制食管鳞癌肿瘤增殖作用的效果。10.免疫组织化学染色:研究柳穿鱼黄素处理后的肿瘤组织中pRB1T826以及增殖标记分子Ki67表达细胞的阳性率。结果1.细胞的毒性实验:结果表明,柳穿鱼黄素在20 μM时对食管鳞癌细胞有明显的毒性作用。2.细胞的增殖实验:柳穿鱼黄素可以呈剂量依赖性抑制食管鳞癌细胞的增殖。3.软琼脂克隆形成实验:柳穿鱼黄素在10 μM时可以明显抑制食管鳞癌细胞的软琼脂克隆形成能力。4.平板克隆形成实验:该实验进一步证实柳穿鱼黄素在10μM时可明显抑制食管鳞癌细胞克隆的能力。5.蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学实验:柳穿鱼黄素可以显著下调pYAPS109、pSTAT3Y705、pNFκBS907、pMAPK3T202、pGSK-3BY216和 pRB1T826 的磷酸化水平。6.蛋白免疫印迹实验:柳穿鱼黄素可以显著抑制食管鳞癌细胞中pYAPS109、pSTAT3Y705、pNFκBS907、pMAPK3T202、pGSK-3BY216 和 pRB1T826 的磷酸化水平。7.分子下拉实验与计算机分子模拟对接实验:表明柳穿鱼黄素可以与CDK6分子直接结合。8.体外激酶实验:CDK6可以在Tyr826位点上磷酸化RB1蛋白,同时柳穿鱼黄素可以直接作用于CDK6蛋白而抑制CDK6对RB1的磷酸化作用。9.PDX模型:柳穿鱼黄素可以明显抑制人源性食管鳞癌肿瘤的增殖,肿瘤的重量与体积均随药物剂量增高而降低。10.免疫组织化学染色:柳穿鱼黄素可以显著降低食管鳞癌肿瘤组织中pRB1T826与细胞增殖标记物Ki67的水平。结论柳穿鱼黄素能降低 pYAPs109、pSTAT3Y705、pNFκBs907、pMAPK3T202、pGSK-3BY216的磷酸化水平抑制食管鳞癌的增殖,它还可以通过与CDK6蛋白激酶结合,降低CDK6对RB1在Tyr826位点的磷酸化激活作用,来发挥抑制食管鳞癌细胞的增殖作用。