目的:血栓栓塞性疾病(thrombotic disease,TD)是一种常见病和多发病,发病率、致残率、致死率皆高。药物溶栓是目前临床最有效的治疗手段。迄今为止,溶栓剂已发展了三代,但仍然存在一定的缺陷,有待研究开发出安全有效的新型溶栓剂。本研究旨在从海洋动物单环刺螠(Urechis unicinctus)体内提取纯化出一种新型的生物溶栓剂,在此基础上确定其分子特征、酶免疫原性,并克隆部分编码区cDNA,为进一步开展基因工程菌的构建,重组活性蛋白的表达的深入研究奠定基础。方法:将单环刺螠体腔液经离心,经分子量8,000Da和30kD截留分子量滤膜超滤、Sephadex G-75、DE 52阴离子交换层析柱和Sephacryl S-100HR凝胶柱分离等步骤进行酶的分离纯化。SDS-PAGE电泳和HPLC鉴定纯度,测定其分子量。N端测序及质谱从头测序(de novo)确定该酶的部分氨基酸序列。为研究单环刺螠纤溶酶作为一种潜在药物,其对药物安全性评价的影响和动物体内过敏反应,对该纤溶酶进行了初步免疫原性研究,以天然纤溶酶和加热变性纤溶酶分别免疫新西兰兔,采用背部皮下和后腿肌肉多点注射进行免疫,琼脂双向扩散法测定纤溶酶抗体效价。采用RT-PCR的方法,根据N端及另外3段氨基酸序列设计10条简并引物,组成18种组合,以单环刺螠消化道组织总RNA为模板,用RT-PCR的方法尝试克隆该种纤溶酶组分的cDNA片段。结果:通过酶的纯化最终获得一种纯酶组分,在SDS-PAGE电泳图谱上显示一条蛋白区带,经HPLC鉴定呈现单一峰,说明为纯品。蛋白质分子量测定为约26.4kDa。酶纯化倍数为10.2,回收率为13.9%,比活力达421.9U/mg。经专一性水解酶降解,N端测序及质谱分析,获取酶分子中5段多肽链的氨基酸序列,分别为:N端:ICGGSPADIT;中间部分序列:DMKR;RNRLPHACMPZR;ACVWYFVH;BNEGGYLDACM。经Blastp比对分析,没有发现同源性较高的序列,说明此酶为一种新发现的蛋白酶。琼脂双向扩散平板未出现免疫沉淀线,表明该酶免疫原性低,在兔体内未产生可检测的抗体量。本实验中克隆得到了3个基因片段,经Blastp搜索分析,其中2个片段与蚯蚓、白蚁等动物来源的内切葡聚糖酶相似性较高,1个与septin基因家族成员septin 11相似性较高。但设计引物所依据的氨基酸序列是根据质谱图推算出的,这种方法鉴定的可靠性有待进一步确定。可能需要再结合传统化学方法进行末端氨基酸序列测定,再分离基因。数据库所给出的结果虽然显示了一定的相似性,但尚不能确定获得的序列与搜索到的基因是同一类基因,也有可能是一种全新的具有纤溶活力的蛋白质。要最终证明其是否为纤维蛋白溶解酶,需要通过克隆全长cDNA序列,在原核或真核生物中表达,获得重组蛋白,测定是否具有纤溶活力。