东亚三角涡虫(Dujesia japonica)是扁形动物门的代表动物。从这类动物开始出现了两侧对称和中胚层。由于其特殊的演化地位和极强的再生能力,为我们研究动物进化、胚胎发育及再生机理等提供了优良材料。PREB(prolactin regulatory element binding)蛋白属于WD重复蛋白家族,在基因调控中发挥作用。真核细胞染色体cohesin蛋白复合体有两种亚型,每种亚型都包含有Smc1,Smc3,Scc1亚基以及Scc3亚基的一种直系同源蛋白STAG1/SA1或STAG2/SA2。STAG蛋白除了在染色体有丝分离的过程中发挥作用外,还作为转录共激活因子与其他转录因子一起参与了蛋白之间的相互作用。然而,涡虫Preb和Stag基因的结构和功能尚不清楚。研究东亚三角涡虫Preb和Stag基因的结构以及在胚胎发育和再生过程中的表达和功能,在理论上会丰富Preb和Stag基因的性质,在实践上为动物再生机制的探索提供实验参考。　　 本研究从东亚三角涡虫(Dugesia japonica)cDNA文库中,克隆了具有完整编码框的Preb基因(DjPreb)和Stag基因(DjStag),利用整体原位杂交、荧光Real-Time PCR、RNA干扰等方法进行了基因表达图式和功能研究,并利用生物信息学方法分析了DjPreb、DkStag的进化关系。这些研究使我们对Preb和Stag基因有了进一步的理解和认识。　　 1.东亚三角涡虫DjPreb基因的性质和表达研究　　 DjPreb全长1101 bp,最大开放阅读框为972个碱基,编码323个氨基酸组成的蛋白。5非翻译区含有69个碱基,3非翻译区含有60个碱基。BLAST分析表明DjPreb是PREB成员。基因组分析表明,DjPreb基因含有两个外显子,一个内含子。　　 整体原位杂交检测Djfeb基因在D.jraponica涡虫胚胎发育过程的表达情况表明在第三胚胎时期未检测到信号,在胚胎的第4阶段首次检测到DjPreb基因阳性信号,在胚胎外围的一些细胞表达。第5阶段,阳性信号增加。在第6阶段,主要在胚胎前端和背腹侧区域检测到阳性信号。第7阶段,在沿着A-P轴的背外侧以及实质组织中检测到阳性信号。DjPreb基因在第8阶段和幼虫阶段,不仅在涡虫的头尾分化组织中检测到了阳性信号,在背腹外侧的实质组织中也检测到了阳性信号。有趣的是,DjPreb的表达在头部产生梯度,头部的前端信号强,后端弱。说明DjPreb在头尾的形成和前后轴的模式形成中发挥调节作用。　　 整体原位杂交和荧光相对定量PCR检测DjPreb基因在涡虫不同再生阶段的时空表达情况表明,DjPreb在完整未切涡虫和再生涡虫都呈梯度表达,在前端和后端信号强,在中部信号最弱。再生过程中DjPreb表达量激增,在前后端形成的胚芽基中检测到强信号。表明DjPreb在涡虫再生过程组织形成中发挥重要作用,可能参与了头尾的形成。　　 2.东亚三角涡虫DjStag基因的性质和表达研究　　 DjStag cDNA全长1362 bp,含有一个489碱基的最大开放阅读框,编码一个162氨基酸组成的蛋白质。其编码的蛋白在5端有一起始密码子ATG,包含有170个碱基的5端非翻译区;3端非翻译区长703个碱基。BLAST表明DiStag是STAG/STAG-like成员。　　 整体原位杂交分析DjStag基因在涡虫胚胎不同发育时期的时空表达情况表明在早期胚胎阶段DjStag主要在胚带表达。第5阶段,胚带上的阳性信号增加。在后面阶段,DjStag主要在胚胎背外侧表达。幼虫阶段,DjStag不仅在头尾强烈表达,而且在表皮和肠表皮之间的实质组织表达。表明DjStag不仅在分化细胞中表达而且还在即将成为成虫干细胞的子细胞集中表达。　　 用原位杂交和荧光相对定量PCR分析来自头部,尾部和中部的再生片段在再生过程中DjStag的表达变化。所有的结果包括来自头部,尾部和中部的再生片段表明再生第3天在胚芽基首次检测到信号;再生第5天DjStag的表达量最大;再生第7天,DjStag微弱表达。在这三种不同再生过程中DjStag的表达模式没有明显差异。相对定量PCR分析表明,以完整未切涡虫的表达水平作为参照。在不同的再生时间下,涡虫DjStag基因表达量有所增加,再生第5天表达量达到峰值。说明涡虫再生过程中DjStag在维持多能性干细胞再生出缺失组织的能力中发挥作用。　　 3.东亚三角涡虫DjPreb和DjStag基因的功能研究　　 构建了涡虫L4440-DjPreb和L4440-DjStag重组干扰质粒,转化到大肠杆菌HT115中诱导产生dsRNA后喂养涡虫,干扰涡虫体内DjPreb和DjStag基因的表达,观察涡虫再生过程中的形态学变化,并采用Real-time PCR检测RNA干扰后涡虫DjPreb和DjStag基因在再生过程中的表达量,探索DjPreb和DjStag在涡虫再生过程中的功能。　　 通过DjPreb和DjStag基因干扰实验,可以确定DjPreb和DjStag基因的dsRNA对涡虫DjPreb和DjStag基因有干扰作用,影响再生正常进行。再生片段显示出明显的再生缺陷,如锯齿状的后部胚芽基,不能再生尾部,整个身体变得厚重,不能再生眼点,咽和尾部再生缺陷等。相对荧光定量PCR分析表明与对照相比RNAi后DjPreb和DjStag的表达显著下降。