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第一部分肽功能化载HMME-Gd相变纳米粒的制备和表征的实验研究目的制备肽功能化载HMME-Gd相变纳米粒PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd),检测纳米粒的基本表征如:粒径、电位、表面形态、包封率等,并检测其体内外靶向性和安全性等。方法1.纳米粒的制备及表征:采用薄膜水化法、声振法制备肽功能化载HMME-Gd相变纳米粒,即PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)。用Malvern粒径电位测量仪检测粒径和电位;透射电子显微镜观察其形态;紫外分光光度计检测包封率。2.体内外靶向性1)体外靶向性:分别用流式细胞仪及激光共聚焦显微镜观察PFP@LIP-H(Gd)和PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)对MDA-MB-231细胞及人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的靶向性。2)体内靶向性:建立MDA-MB-231乳腺癌荷瘤模型,经尾静脉注射Di I标记的非靶向组(PFP@LIP-H(Gd))和靶向组(PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd))纳米粒,以注射生理盐水为对照组,不同时间(1,2,4,6,12,24h)后处死裸鼠,剥离肿瘤组织制成冰冻切片,用荧光显微镜观察两种纳米粒在肿瘤组织的分布情况。3.体内外安全性1)体外安全性:将不同浓度的PFP@LIP、PFP@LIP-H(Gd)、PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)与MDA-MB-231细胞共孵育24h后,用CCK-8法评价各组纳米粒对MDA-MB-231细胞的细胞毒性。2)体内安全性:将Balb/c小鼠随机分为对照组和实验组(n=3)。对照组为注射生理盐水后14d处死小鼠,实验组为注射纳米粒后(第1,5,7,14d)处死小鼠,收集小鼠血液样本,将收集的血液样本进行血常规和血生化分析。结果1.纳米粒表征:透射电子显微镜可见PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)为球形;Malvern粒径电位测量仪粒径为(260.93±5.28)nm,电位为(-15.7±2.646)m V;紫外分光光度计测得HMME-Gd包封率约为93.33%。2.体内外靶向性1)体外靶向性:激光共聚焦显微镜显示,Di I标记的PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)可靶向聚集到MDA-MB-231细胞膜周围,且随着时间的延长进入到细胞质内越多,而正常的HUVEC细胞周围未见明显的聚集;同时,由于没有t Ly P-1的靶向和穿膜作用,Di I标记的PFP@LIP-H(Gd)在MDA-MB-231细胞周围也未见明显的聚集;流式细胞仪检测结果与激光共聚焦显微镜保持一致。2)体内靶向性:荧光显微镜显示,靶向组注射1h后可在肿瘤区域观测到大量红色荧光富集,随着时间的延长,红色荧光越多(P<0.05);而非靶向组注射1h后,仅观测到微量红色荧光分布于肿瘤部位,24h后未见红色荧光分布(P>0.05)。3.体内外安全性1)体外安全性:CCK-8法显示不同浓度的纳米粒对MDA-MB-231细胞均无明显细胞毒性(P<0.05)。2)体内安全性:小鼠的血液检测指标显示各实验组与对照组相比未见明显异常(P>0.05)。结论成功制备肽功能化载HMME-Gd相变纳米粒,即PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd),其大小均一、分散性较好,包封率较高,对MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231乳腺癌荷瘤鼠具有明显的靶向效果,体内外安全性好。第二部分肽功能化载HMME-Gd相变纳米粒多模态成像的实验研究目的观察该纳米粒在体内外的超声成像、光声成像、荧光成像及MRI成像效果。方法1.体内外超声成像1)体外超声成像:(1)声致相变:将稀释后的PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)用LIFU(1.6W/cm2,脉冲模式)辐照不同时间(辐照前,1,2,3,4min),用光学显微镜观察纳米粒相变情况;(2)声致相变增强超声成像:将PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)稀释数倍后放进凝胶模型内,采用不同功率LIFU(0.8,1.6,3.2W/cm2;脉冲模式)辐照不同时间(辐照前,1,2,3,4min)为实验组,以不含PFP的t Ly P-1-LIP-H(Gd)经LIFU(1.6W/cm2,脉冲模式)辐照不同时间(辐照前,1,2,3,4min)为对照组,超声诊断仪观察实验组和对照组的超声模式(US-mode)和造影模式(CEUS-mode)显影情况,用DFY定量分析诊断仪测量各组超声图像的灰度值。2)体内超声成像:建立MDA-MB-231移植瘤模型,随机分为两组:对照组(PFP@LIP-H(Gd))和实验组(PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)),用超声诊断仪采集经尾静脉注射纳米粒前(Pre),注射2h后(2h)及注射2h用LIFU(1.6W/cm2,2min,脉冲模式)辐照后(2h+LIFU)肿瘤区域US-mode和CEUS-mode的显影情况,用DFY定量分析诊断仪测量各组超声图像的灰度值。2.体内外光声成像1)体外光声成像:PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)配制成不同浓度(0.15625-5mg/m L)进行光声成像检测,并评价光声信号与PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)浓度的线性关系。2)体内光声成像:建立MDA-MB-231移植瘤模型,随机分为两组:对照组(PFP@LIP-H(Gd))和实验组(PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)),用光声仪采集经尾静脉注射纳米粒后不同时间(注射前,2,6,8,12,24h)肿瘤区域光声图像,定量分析各组光声信号。3.体内外荧光成像1)体外荧光成像:将Di R标记的PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)稀释成不同浓度(0.009765625-5mg/m L),加入96孔板中,每孔100μL,每个浓度3个复孔,用小动物活体荧光成像系统观察及定量分析各浓度荧光分布。2)体内荧光成像:建立MDA-MB-231移植瘤模型,随机分为两组(n=3):对照组(PFP@LIP-H(Gd))和实验组(PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)),用小动物活体荧光成像系统采集经尾静脉注射纳米粒后不同时间(注射前,2,6,8,12,24h)裸鼠活体荧光分布,并采集荧光图像,测量肿瘤区域的荧光信号值。24h后处死裸鼠,剥离肿瘤组织及主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)进行离体组织荧光成像,采集荧光图像,并测量肿瘤组织及主要脏器的荧光信号值。4.体内外MRI成像1)体外MRI成像:将PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)按Gd3+的剂量配置成(0.015-0.1m M)后分别加入2m L离心管后置于核磁共振仪中进行T1加权成像,评价弛豫率与PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)中Gd3+剂量的线性关系。2)体内MRI成像:建立MDA-MB-231移植瘤模型,随机分为两组:对照组(PFP@LIP-H(Gd))和实验组(PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)),用MRI成像系统采集经尾静脉注射纳米粒后不同时间(注射前,2,6,12,24h)裸鼠肿瘤部位的T1加权成像,并分析肿瘤区域的T1加权图像信号值。结果1.体内外超声成像1)体外超声成像:(1)声致相变:光学显微镜显示该纳米粒体积随LIFU辐照时间延长而逐渐变大(′100);(2)声致相变增强超声成像:超声诊断仪结果显示实验组的超声模式和造影模式的超声图像在一定范围具有LIFU功率和辐照时间依赖性;而对照组的超声图像在LIFU辐照前后未见明显变化(P>0.05)。DFY定量分析诊断仪分析结果与超声图像一致。2)体内超声成像:在注射纳米粒之前,实验组和对照组的肿瘤区域均为低回声,实验组在注射纳米粒2h后回声稍增强,经LIFU辐照后超声模式及造影模式的回声信号均有明显增强(P<0.05),而对照组的超声图像的回声信号无明显变化(P>0.05)。DFY定量分析诊断仪分析结果显示一致。2.体内外光声成像1)体外光声成像:光声仪显示,PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)的光声信号与其浓度呈线性关系;2)体内光声成像:在注射纳米粒之前,实验组和对照组的肿瘤区域均未见明显光声信号,实验组在注射纳米粒2h后可探及明显光声信号,注射24h仍可探及光声信号(P<0.05),而对照组在注射纳米粒不同时间肿瘤部位的光声图像与注射前无明显变化(P>0.05);定量分析结果与光声图像一致。3.体内外荧光成像1)体外荧光成像:小动物活体荧光成像系统显示,Di R标记的PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)荧光强度随其浓度的增加而增强,但到一定浓度后荧光强度不再增加。2)体内荧光成像:在注射纳米粒之前,实验组和对照组的肿瘤区域均未见荧光信号,实验组在注射纳米粒2h后可在肿瘤区域探及大量荧光信号,注射24h后仍可探及荧光信号(P<0.05),而对照组在注射纳米粒后不同时间肿瘤区域的荧光图像与注射前均未见明显的荧光信号(P>0.05);离体组织荧光图像结果显示对照组主要分布在肝脏、脾脏及少量分布在肿瘤区域,而实验组主要分布在肝脏、脾脏及肿瘤区域;定量分析结果与荧光图像一致。4.体内外MRI成像1)体外MRI成像:核磁共振仪T1加权图像显示,PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)弛豫率与其Gd3+的含量呈线性关系。2)体内MRI成像:注射纳米粒之前,实验组和对照组的肿瘤区域T1加权图像均为低信号,实验组在注射纳米粒2h后肿瘤区域信号明显升高,24h仍可观察到高信号(P<0.05),而对照组在注射纳米粒后不同时间肿瘤区域的MRI图像与注射前均未见明显的信号变化(P>0.05);定量分析结果与T1加权图像一致。结论PFP@tLyP-1-LIP-H(Gd)具有明显的体内外超声成像、光声成像、荧光成像及MRI成像功能,并可有效靶向和富集到肿瘤区域。第三部分肽功能化载HMME-Gd相变纳米粒多功能协同治疗的实验研究目的检测该纳米粒的声动力能力,研究在乏氧和正常氧条件下空化效应和声动力效应协同治疗乳腺癌的体内外治疗效果。方法1.声动力效果检测1)纳米粒水平ROS检测:通过单线态氧荧光探针(singlet oxygen sensor green,SOSG)检测不同浓度PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)在LIFU辐照下产生的ROS,以及LIFU辐照一定浓度纳米粒不同时间所产生ROS的情况。2)细胞水平ROS检测:将MDA-MB-231细胞分为(1)Control组,(2)t Ly P-1-LIP(hypoxia)组,(3)t Ly P-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)组,(4)t Ly P-1-LIP-H(Gd)(normoxia)组,(5)PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)组,(6)Control+LIFU组,(7)t Ly P-1-LIP(hypoxia)+LIFU组,(8)t Ly P-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)+LIFU组,(9)t Ly P-1-LIP-H(Gd)(normoxia)+LIFU组,(10)PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)+LIFU组。上诉各组与DCFH-DA孵育后经LIFU(1.6W/cm2,2min,脉冲模式)辐照,并通过激光共聚焦显微镜观察活性氧的产生情况。2.体外治疗效果1)CCK-8法:(1)将细胞分成PFP@LIP+LIFU组、PFP@LIP-H(Gd)+LIFU组、PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)+LIFU组,用CCK-8法检测各组的细胞活性;(2)将细胞分为t Ly P-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)+LIFU组、t Ly P-1-LIP-H(Gd)(normoxia)+LIFU组和PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)+LIFU组,用CCK-8法检测各组的细胞活性。2)活死细胞双染法:将细胞分为(1)Control组,(2)t Ly P-1-LIP(hypoxia)组,(3)t Ly P-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)组,(4)t Ly P-1-LIP-H(Gd)(normoxia)组,(5)PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)组,(6)Control+LIFU组,(7)t Ly P-1-LIP(hypoxia)+LIFU组,(8)t Ly P-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)+LIFU组,(9)t Ly P-1-LIP-H(Gd)(normoxia)+LIFU组,(10)PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)+LIFU组,用钙黄绿素(calcein-AM,CAM)和碘化吡啶(Pyridinium iodide,PI)进行活死细胞双染色,用激光共聚焦显微镜观察各组细胞存活情况。3.体内治疗将MDA-MB-231荷瘤小鼠随机分为(1)Control组,(2)单纯LIFU组,(3)t Ly P-1-LIP+LIFU组,(4)t Ly P-1-LIP-H(Gd)+LIFU组,(5)PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd),(6)PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)+LIFU组。经尾静脉注射相应的纳米粒,Control组注射等量的生理盐水,4h后用LIFU(1.6W/cm2,2min,脉冲模式)进行辐照,各组观察14天,每3天治疗一次,每2天记录老鼠体重和肿瘤大小。每组荷瘤鼠在处理后24h,随机取一只处死并取出肿瘤及主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑),对肿瘤组织进行H&E和PCNA染色后,使用光学显微镜观察肿瘤细胞增殖和凋亡,并做定量分析;对主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)进行H&E染色评价其生物相容性。结果1.声动力效果检测1)纳米粒水平ROS检测:SOSG检测显示PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)产生ROS的能力具有纳米粒的浓度依赖性及LIFU辐照时间依赖性,随着纳米粒浓度的增加和辐照时间的延长,ROS的产生逐渐增多。2)细胞水平ROS检测:通过DCFH-DA检测发现,t Ly P-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)+LIFU组的绿色荧光明显多于t Ly P-1-LIP(hypoxia)+LIFU组,但也明显低于t Ly P-1-LIP-H(Gd)(normoxia)+LIFU组,而PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)+LIFU组绿色荧光明显多于t Ly P-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)+LIFU组,未经LIFU辐照的各组均未见明显的绿色荧光。2.体外治疗1)CCK-8法显示:(1)常氧条件下,各组纳米粒经LIFU辐照后,随纳米粒浓度的增加,细胞活性均呈降低趋势,其中PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)+LIFU组降低最为明显(P<0.05);(2)乏氧和正常氧条件下经LIFU辐照不同浓度t Ly P-1-LIP-H(Gd)后发现,正常氧条件比乏氧条件的细胞活性低;而乏氧条件下的PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)经LIFU辐照后的细胞活性较(1)中常氧条件稍高。2)活死细胞双染法显示:t Ly P-1-LIP-H(Gd)(hypoxia)+LIFU组的死细胞数量(红色荧光)明显多于t Ly P-1-LIP(hypoxia)+LIFU组,但也明显低于t Ly P-1-LIP-H(Gd)(normoxia)+LIFU组,而PFP@t Ly P-1-LIPH(Gd)(hypoxia)+LIFU组死细胞数量明显多于t Ly P-1-LIP-H(Gd)(hypoxi a)+LIFU组,相反未经LIFU辐照的各组均未见明显的细胞死亡。3.体内治疗PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)+LIFU组在治疗过程结束时显示最大的抑瘤作用,同时,在治疗过程中没有观察到体重的明显变化。此外,肿瘤组织H&E和PCNA可见PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)+LIFU组相对于对照组可见大量凋亡和坏死。同时主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)的H&E染色未见明显损伤。结论PFP@t Ly P-1-LIP-H(Gd)在LIFU作用下产生的声动力效应和空化效应在体外可显著抑制乏氧肿瘤细胞生长,在体内可显著抑制荷瘤裸鼠的肿瘤生长。