产甘露醇菌株的筛选及其生物合成的研究

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甘露醇(mannitol)是一种功能性甜味剂,在人体中代谢与胰岛素无关,常用于制成防龋齿的甜味剂和口中清凉剂等,而且是功能性糖醇中唯一一种不吸湿的晶体。随着人们对甘露醇认识的加深以及对健康饮食的追求,未来全球对甘露醇的需求量将不断增长。然而,甘露醇现阶段的生产工艺还停留在自然提取法和化学合成法两种,但是发酵法凭借其生产条件温和、同时没有副产物山梨醇生成等优势,势必将在未来取代现有的生产工艺,因此从自然界筛选出一株能高产甘露醇的菌株对于甘露醇的工业化生产及市场应用有着极重要的意义。本文从甘蔗汁中筛选出了一株甘露醇产生菌SK26.001,通过微生物形态观察和18SrDNA序列分析等方法,鉴定其为近平滑假丝酵母,并将其命名为Candida parapsilosisSK26.001,它的18S rDNA序列含有1446个碱基,提交到GenBank,得到登录号为KF255835,并将该菌保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC No. M2012491。从发酵培养基成分和发酵条件两方面对近平滑假丝酵母SK26.001发酵产甘露醇的工艺条件进行研究。通过单因素实验和正交试验得到培养基配方:葡萄糖浓度为200g/L,酵母膏浓度为30g/L,氯化钙浓度为0.15g/L,氯化铁浓度为0.02g/L;发酵条件的最佳值:初始pH为4,装液量为50mL,接种量为4%,温度为30oC,转速为200r/min,在此优化条件下进行摇瓶培养,得到的甘露醇产量为68.5g/L。在摇瓶发酵的基础上,对近平滑假丝酵母SK26.001进行扩大培养,研究甘露醇的分批发酵和补料分批发酵,结果显示,用30L发酵罐进行分批发酵,甘露醇产量在72h达到最大值80.3g/L,之后甘露醇浓度开始下降;用3L发酵罐进行补料分批发酵,初始葡萄糖浓度为200g/L,期间补料4次,整个过程补加葡萄糖84g/L,葡萄糖消耗总量为284g/L,发酵120h产物甘露醇浓度可达到97.1g/L,为工业化生产甘露醇奠定了基础。本文对发酵液中甘露醇的分离纯化方法进行了探索,研究了活性炭脱色、超滤、钙型离子交换树脂分离的条件。确定了活性炭脱色的添加量为3%、温度为40oC、pH为5、脱色时间为40min;选用截留分子量为5000的超滤膜进行超滤;对钙型离子交换树脂分离甘露醇的条件进行研究,分别考察柱温、进样量、流动相流速对分离效果的影响,并绘制分离曲线计算分离度,最后确定钙型离子交换树脂分离甘露醇的温度为60oC、进样量为20mL、流速为1mL/min。此条件下分离纯化所得甘露醇纯度可达98.8%,总得率为31.3%。
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