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研究背景:WHO指出肥胖是全球成年人面临的一种严重的疾病。非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）与肥胖相关的,近年来发病率显著升高,已成为营养、内分泌、消化、遗传、心血管等多学科共同探讨关注的问题。NAFLD的发病机制目前还没有研究清楚,许多的研究发现,促进NAFLD发生的重要因素是脂肪酸的积累。棕榈酸和油酸是在血液和膳食中含量最高的两种脂肪酸。NAFLD与炎症相伴,研究炎症介质和肥胖发生的关系,对肥胖进行早期干预和靶向治疗有一定意义。研究目的:进行L02肝细胞和HepG2细胞脂肪代谢特征和模型筛选,选择最优的模型进行IL-6和脂肪代谢关联的探讨,明确IL-6在L02肝细胞脂肪变性中的作用,体外实验探讨可能的作用机制。研究方法:第一部分,L02肝细胞和HepG2细胞脂肪代谢特征和模型筛选。绘制L02细胞生长曲线,选出适宜细胞接种浓度进行实验。1200、600、300、150、75、37.5、0 μmol/L油酸钠和棕榈酸钠分别孵育L02肝细胞和HepG2肝细胞24h,CCK-8试剂检测细胞活性和上清中IL-6含量。300、150、75和0μmol/L油酸钠分别孵育L02肝细胞和HepG2肝细胞24 h,300、150、75和0μmol/L棕榈酸钠孵育HepG2肝细胞24 h,150、75、37.5和0μmol/L棕榈酸钠孵育L02肝细胞24 h,油红染色观察细胞脂质蓄积情况,检测细胞中甘油三酯含量,免疫印迹法检测沉默信息调节因子1（silent information regulator 1,SIRT1）和核因子-κB（nuclear factor κB,NF-κB）的表达,流式细胞仪检测细胞表面Toll样受体2（Toll-like receptor,TLR2）和TLR4的表达。分别使用完全培养基和不完全培养基稀释油酸钠,以300、75和0μmol/L油酸钠孵育L02肝细胞,24h后取上清,通过ELISA方法检测上清液中IL-6,气相色谱质谱联用仪检测上清液中FFA,油红O染色试剂盒进行细胞脂质沉积染色。第二部分,IL-6与L02肝细胞脂肪代谢关联。将L02肝细胞与1200、600、300、150、75、37.5、0μmol/L油酸钠孵育24小时,并收集上清液检测IL-6。将300、150、75μmol/L 和 0 油酸钠孵育 L02 肝细胞 0、0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、18、20、22、24h。收集上清液并离心,检测上清中的IL-6和FFA;BODIPY 493/503对L02肝细胞进行染色观察脂质蓄积情况。300μmol/L油酸钠孵育L02肝细胞0、0.5、1、2、4、6、8、10、12、14、16、20、24h,油红 O 染色试剂盒对 L02 肝细胞进行染色,评价脂质蓄积情况。第三部分,IL-6在L02细胞脂肪变性中的作用。完全培养基稀释IL-6浓度为400、100、25、6.250、1.563、0.391、0.098、0.024、0.006pg/mL 和 0pg/mL IL-6,加入到L02肝细胞中。每个浓度12个平行孔,孵育24h,每个浓度取6个孔,吸取上清后,加入CCK-8溶液,在温箱中孵育2h,酶标仪检测450nm吸光度值;剩余6个孔,弃去上清,底部细胞做油红染色。10%BSA培养基稀释IL-6浓度为100、33.3、8.325、2.081、0.520、0.130、0.033、0.008、0.002pg/mL 和 0pg/mLIL-6,加入到L02肝细胞中。每个浓度12个平行孔,孵育24h,每个浓度取6个孔,吸取上清后,加入CCK-8溶液,在温箱中孵育2h,酶标仪检测450nm吸光度值;剩余6个孔,弃去上清,底部细胞做油红染色。25pg/mL和2.5pg/mL IL-6以及完全培养基溶液加入到L02细胞中,每个浓度7个复孔,孵育过夜,弃去上清,BODIPY 493/503和DAPI试剂染色,ImageJ软件计算同一个视野的绿色和蓝色荧光面积,并计算比值,代表脂质蓄积情况。油酸钠高低浓度分别为300μmol/L、75μmol/L,IL-6高低浓度为25pg/mL、2.5pg/mL,实验设7个组,即油酸钠高浓度IL-6高浓度组,油酸钠高浓度IL-6低浓度组,油酸钠高浓度组,油酸钠低浓度IL-6高浓度组,油酸钠低浓度IL-6低浓度组,油酸钠低浓度组,无油酸钠无IL-6组,孵育24h后,流式细胞仪检测L02肝细胞脂质沉积和CD36表达情况。第四部分,siRNA阻断IL-6的转录对CD36表达和脂肪合成的影响。IL-6 siRNA转染L02肝细胞,RT-PCR检测细胞内IL-6 mRNA转录情况;油红染色观察IL-6 siRNA加入后对油酸钠引起L02肝细胞脂质沉积的影响,另外流式细胞仪检测细胞表面CD36表达和脂质蓄积情况。研究结果:1.随着油酸钠浓度增加,细胞活性下降,细胞生长抑制率升高。与无油酸钠无棕榈酸钠组细胞相比,1200、600、300、150μmol/L油酸钠孵育L02细胞上清中IL-6含量显著升高,差异具有统计学意义（P<0.001）,75μmol/L油酸钠孵育L02细胞上清中IL-6含量显著升高,差异具有统计学意义（P<0.01）,1200μmol/L实验组IL-6含量高于600μmol/L实验组,差异具有统计学意义（P<0.001）,600μmol/L实验组IL-6含量显著高于300μmol/L实验组,差异具有统计学意义（P<0.01）;1200、600、300 μmol/L棕榈酸钠实验组细胞上清中IL-6含量显著高于无棕榈酸钠无油酸钠对照组,差异具有统计学意义（P<0.001）,1200μmol/L实验组IL-6含量显著高于600μmol/L实验组,差异具有统计学意义（P<0.001）,600μmol/L实验组IL-6含量显著高于300μmol/L实验组,差异具有统计学意义（P<0.001）,300μmol/L实验组IL-6含量显著高于150μmol/L实验组,差异具有统计学意义（P<0.001）。300、150和75μmol/L油酸钠干预L02肝细胞甘油三酯含量明显高于无油酸钠无棕榈酸钠对照组,差异具有统计学意义（P<0.001、P<0.001和P<0.01）,300μmol/L油酸钠显著升高HepG2肝细胞中甘油三酯含量,差异具有统计学意义（P<0.01）,300μmol/L棕榈酸钠作用于HepG2肝细胞甘油三酯含量明显高于无油酸钠无棕榈酸钠对照组,差异具有统计学意义（P<0.01）。300、150和75μmol/L油酸钠分别孵育L02肝细胞和HepG2肝细胞24 h,300、150和75μmol/L棕榈酸钠孵育HepG2肝细胞24 h,150、75和37.5μmol/L棕榈酸钠孵育L02肝细胞24 h,油红染色观察到脂滴在细胞蓄积,无油酸钠无棕榈酸钠对照组细胞油红染色无明显脂质蓄积。300和150μmol/L油酸钠干预L02肝细胞TLR2表达显著高于无油酸钠无棕榈酸钠对照组,差异具有统计学意义（P<0.001和P<0.05）;300和150 μmol/L棕榈酸钠干预L02细胞TLR2表达显著高于无棕榈酸钠无油酸钠对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）;TLR4表达未见显著上升。油酸钠各剂量组和棕榈酸钠高剂量组L02肝细胞SIRT1蛋白表达低于无棕榈酸钠无油酸钠对照组,油酸钠高中低剂量组和棕榈酸钠高中剂量组L02肝细胞和HepG2肝细胞NF-κB p65表达高于无棕榈酸钠无油酸钠对照组,油酸钠高剂量组和棕榈酸钠中剂量组PPARγ表达显著高于无棕榈酸钠无油酸钠对照组。MEM完全培养基溶解油酸钠孵育L02细胞上清中IL-6含量随油酸钠含量降低而降低,而10%BSA MEM培养基溶解油酸钠孵育L02肝细胞上清中IL-6含量与油酸钠则没有明显的剂量反应关系。10%BSA MEM培养基孵育细胞,各个剂量油酸钠引起L02肝细胞脂质蓄积程度要低于完全培养组,显微镜观察细胞生长状态要差于MEM完全培养基组细胞。综上,300μmol/L油酸钠孵育L02肝细胞脂质沉积模型最佳。2.随着油酸钠孵育时间的延长,L02肝细胞上清中IL-6的浓度增加。油酸钠孵育L02肝细胞24小时后,细胞上清中IL-6浓度随着油酸钠的孵育浓度增加而增加。随着油酸钠孵育L02细胞时间的延长,上清液中的FFA含量降低。随着油酸钠孵育浓度的提高和孵育L02细胞时间延长,L02肝细胞脂质蓄积程度增加。从2小时开始,300μmol/L油酸钠孵育L02肝细胞后油红染色加深。3.在10%BSA不完全培养基中,IL-6浓度从0.033pg/mL开始,随着浓度上升,L02细胞的活性逐渐降低。100pg/mL IL-6在完全培养基中对L02细胞无抑制作用。IL-6溶解在10%BSA不完全培养基和完全培养基中孵育L02细胞,油红染色都观察到L02细胞脂质蓄积现象。BODIPY 493/503和DAPI染色观察IL-6引起L02细胞脂质蓄积情况发现25pg/mL IL-6处理组细胞脂质沉积情况显著高于无IL-6对照组,差异具有统计学意义（P<0.01）;25pg/mL IL-6处理组细胞脂质沉积情况显著高于2.5pg/mL IL-6处理组,差异具有统计学意义（P<0.05）。2.5pg/mL IL-6显著升高300μmol/L油酸钠和75μmol/L油酸钠诱导的细胞脂质蓄积水平,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。4.qPCR结果表明IL-6 siRNA均抑制L02肝细胞IL-6的转录,未检测到IL-6 mRNA;IL-6 siRNA加入后,上清中IL-6含量减低,但未见显著性差异。IL-6转录受到抑制后,CD36表达受到抑制,脂质合成受到抑制。研究结论:1.筛选的油酸钠干预L02肝细胞脂质沉积和炎症反应模型适用于IL-6与脂肪代谢观察。油酸钠诱导L02肝细胞分泌IL-6可能通过TLR2/NF-κB作用通路实现;油酸钠诱导L02脂质蓄积与IL-6/PPARγ有关。2.油酸钠引起L02肝细胞分泌IL-6和脂质蓄积具有剂量依赖性和时间依赖性。3.IL-6可以促进L02细胞脂质合成,也促进油酸钠诱导的L02细胞脂质合成。4.本实验提示油酸钠诱导脂质合成可能与IL-6/CD36有关,IL-6和CD36之间也存在作用关系。5.综合上述研究结果,油酸钠诱导IL-6产生的作用通路可能为TLR2/NF-κB/IL-6,IL-6诱导脂质合成的作用机制可能为IL-6/CD36/PPARγ,所以油酸钠诱导L02肝细胞脂质合成可能是通过TLR2/NF-κB/IL-6/CD36/PPARγ作用通路实现。