布拉氏酵母菌（Saccharomyces boulardii）是1920年从印尼水果中分离得到的一种非致病性酵母菌，作为益生菌被欧洲、非洲和南非等国家广泛的应用于治疗和预防腹泻和肠道失调。布拉氏酵母菌被认为是最有价值的益生菌之一。传统意义上，益生菌作为食物添加剂来改善肠道微生物平衡，还可以用来治疗感染性胃肠炎和治疗过程中抗生素引起的并发症性腹泻。对布拉氏酵母菌益生性的研究成为热点。然而，多数研究着眼于生产和临床应用，关于布拉氏酵母菌益生机制特别是分子方面的研究却很少。其主要的原因是，没有适合布拉氏酵母菌的分子遗传工具。包括关键基因的敲除、调控表达、表面展示等。研究表明，布拉菌是酿酒酵母(S. cerevisiae)的变异株。尽管很多研究证明布拉氏酵母菌是酿酒酵母的一个分支，但是却有一些完全不同于酿酒酵母的生物学、生理学、代谢及遗传学特性，例如，布拉氏酵母菌不能利用半乳糖，对低pH和温度有很高的耐受性，并且在氮源缺乏时可以形成假菌丝，特别是布拉氏酵母菌是双倍体而且不能孢子化。许多适用于酿酒酵母的分子遗传工具不能直接用于布拉氏酵母菌。想要研究布拉氏酵母菌益生机制，需要构建适合的分子遗传工具。本研究旨在建立一套有效的适用于布拉氏酵母菌的基因敲除体系，主要以成熟应用于酿酒酵母及其他真菌中的用同源重组的技术和Cre-loxP系统为基础，以URA3基因为目的基因进行敲除系统的构建，筛选出合适的筛选标记，将原始质粒pZC1改造成带有多克隆位点的质粒pSBGD。然后通过PCR的方法和克隆的方法构建两侧带有短（长）同源臂的loxP-marker-loxP基因敲除组件，选择适合布拉氏酵母菌的转染方法进行转染，将构建好的基因敲除组件转染到酵母基因组中，同时利用带有cre基因的质粒实现筛选标记的重复利用，通过筛选标记的筛选并经过PCR鉴定得到突变株。URA3基因缺失的突变株表现为不能在营养缺陷型培养基中生长，而将URA3基因重新导入到突变株中后可以在营养缺陷型培养基中生长。该系统可以通过PCR方法和克隆方法进行基因敲除，还可以将敲除的基因重新导入到突变株中，除了在目的基因处残留34个碱基外，外源基因都可以从菌体内删除。布拉氏酵母菌基因敲除系统的成功构建，为从分子水平上研究布拉氏酵母菌的作用机理、基因调控通路和机理提供了强有力的手段。通过进行功能基因的敲除、插入及染色体基因的交换，进而阻断微生物细胞的代谢旁路、减弱毒/副作用、强化目标产物的产量或质量奠定坚实基础或通过细胞壁成分的分析进行抗真菌药物研制。本研究将构建的系统应用于布拉氏酵母菌MCD4基因进行基因敲除，筛选出正确的突变株，然后进行基因表型的研究。MCD4基因缺失的突变株表现为：生长速度缓慢、细胞形态上变大变圆、细胞壁中β-葡聚糖的含量升高和细胞壁对刚果红的敏感性增加，将MCD4基因重新导入到突变株中后，相对于突变株来说，生长速度提高、细胞形态有一定的恢复、细胞壁中β-葡聚糖的含量降低，并且细胞壁对刚果红的敏感性降低。