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小麦是重要粮食作物,在世界范围内广泛种植。赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是主要由禾谷镰刀菌引起的一种小麦全球性真菌病害,多发生在温暖潮湿地区。小麦赤霉病不仅使小麦严重减产,而且致病菌分泌多种毒素,这些毒素能长期留存在食物链中,严重威胁人畜健康。培育抗病品种是解决小麦赤霉病的最好途径。但在小麦及其近缘作物中缺乏优良抗病种质资源,导致抗赤霉病常规育种进展缓慢。随着基因工程技术和生物信息学的快速发展,人们开始从更广泛的领域寻找赤霉病抗性基因。本研究主要把抗赤霉病病相关基因和靶标RNAi片段构建最小表达框,分别通过基因枪多基因共转化法和农杆菌介导的双元表达载体导入襄麦76和扬麦158中,旨在获得抗赤霉病株系,为抗赤霉病转基因育种提供新材料。主要获得以下结果:1.转靶标RNAi基因片段小麦的筛选与赤霉病抗性鉴定。1)利用基因枪介导的遗传转化方法,将赤霉菌几丁质合酶(chitinsynthase,chs)基因的RNAi片段chs3bAS2-chs3bAS2和chs3bAS5-chs3bAS1,以及标记基因PMI(Phosphomannoseisomerase,PMI),共转化小麦品种襄麦76,筛选获得2个转基因株系ZC1和ZC2。T1～T3代PCR鉴定表明,转入的基因能稳定遗传,但出现2个目的基因分离现象。T2、T3代进行单花接种鉴定结果表明:ZC1和ZC2株系较未转化襄麦76赤霉病抗性有显著提高,含目的基因chs3bAS5-chs3bAS1和chs3bAS2-chs3bAS2的植株比仅有目的基因chs3bAS5-chs3bAS1植株的抗性较好,T3代时达到显著性差异。因此,以Chs3b基因不同RNAi片段为靶标的寄主诱导的基因沉默(Host-induced gene silencing,HIGS)技术,能有效提高小麦的赤霉病抗性,RNAi-chs3b基因抗性具有累加效应。2)将赤霉菌几丁质合酶和葡聚糖合酶(Glucansynthare,Gls)基因的RNAi片段glsAS3-glsAS6、chs3bAS2-chs3bAS 和chs3bAS5-chs3bAS1,以及筛选标记基因PMI,同上方法转入襄麦76,筛选获得1个转基因株系A3-3。T1、T2代PCR鉴定表明,转入的基因能稳定、连锁遗传;将A3-3株系与未转化襄麦76杂交,对其杂交后代的PCR鉴定表明,转入基因已通过有性杂交转移到未转化小麦基因组中,不同基因呈连锁遗传。3)将除草剂抗性基因Bar(bialaphos resistance,Bar)与赤霉菌基因RNAi片段CYP51、chs3bAS2-chs3bAS2和chs3bAS5-chs3bAS1一起,经基因枪法转化襄麦76,通过对转基因材料T1、T2的分析与鉴定,发现6个转基因株系可分为三种不同基因型:①BC1株系同时含有标记基因Bar和3个目的基因CYP51、chs3bAS2-chs3bAS2和chs3bAS5-chs3bAS1,②BC4株系仅含标记基因Bar和目的基因chs3bAS2-chs3bAS2,③BA1、BA2、BC2和BC3 4个株系均只含目的基因chs3bAS2-chs3bAS2 不含 Bar 基因。4)将含有不同调控元件的赤霉菌RNAi片段glsAS3-glsAS6(tRNA)和6×chs3bAS5-2以及PMI基因,以基因枪转化襄麦76,筛选获得1个转基因株系DC。TO代PCR鉴定表明,DC株系同时含有标记基因PMI和目的基因glsAS3-glsAS6(tRNA)和 6×chs3bAS5-2。5)通过农杆菌介导法,将赤霉菌TamiR(4)转入小麦品种扬麦158,筛选获得1个转基因株系Y4-2,TO代PCR鉴定表明,Y4-2株系同时含有标记基因PMI和目的基因TamiR(4)。2.转抗病相关基因小麦的筛选与分析。将拮抗细菌丰原素基因fenB和筛选标记PMI基因,通过基因枪法导入小麦品种襄麦76,筛选获得2个转基因株系FB1和FB2,分别含有目的基因fenB和标记基因PMI。FB1和FB2株系目前处于T4代,不同时代PCR鉴定结果显示:目的基因与标记基因趋于纯合且连锁遗传。3.转乙醇酸途径基因小麦的鉴定与农艺性状分析。1)鉴定转乙醇酸途径3个关键酶基因AtGDH、GcL、TsR的2个小麦(受体品种为襄麦76)转基因株系ZQ1和ZQ2,T5、T6代PCR及RT-PCR鉴定结果显示,2个转基因株系的转基因均已完全纯合,转基因在RNA水平高效表达。ZQ株系T6代农艺性状分析:ZQ1和ZQ2株系株型紧凑,一些农艺性状与野生型不同。2)鉴定转乙醇酸脱氢酶融合基因DEF的3个转基因株系UD、CD和ZX,其中UD和ZX株系转基因的启动子为Ubi,CD株系转基因的启动子是CMPS。UD株系T5、T6代PCR鉴定表明,转基因分离较大;而CD和ZX株系的T3、T4代的PCR鉴定显示,转入的基因能稳定遗传且逐渐趋于纯合。