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己烯雌酚为人工合成的二苯乙烯类雌激素药,曾经作为促生长剂广泛应用于畜牧业,以促进动物生长,提高产量。但国内外研究表明,己烯雌酚具有很强的副作用,可以破坏机体遗传物质,导致基因突变而引发机体肿瘤。目前,世界上许多国家已规定在畜禽及水产养殖中禁用DES。然而,当前滥用己烯雌酚的现象依然存在。为了确保人类安全与健康,建立快速、准确地检测动物性食品中DES残留是十分必要的。本研究以己烯雌酚、琥珀酸酐和牛血清白蛋白等为主要原料,首先通过琥珀酸酐酰化,生成己烯雌酚半琥珀酸酯,然后采用混合酸酐反应(氯甲酸异丁酯法)将己烯雌酚半琥珀酸酯与牛血清白蛋白进行偶联制备己烯雌酚免疫原,并与卵清蛋白进行偶联制备己烯雌酚包被原。用此免疫原免疫家兔,并以间接ELISA法测定抗体效价。试验结果表明,被免疫兔血清中的抗DES抗体效价高达28,证明合成的人工抗原具有很强的免疫原性,能够刺激兔体分泌高效价的目的抗体。通过检测免疫兔血清中的抗体效价,建立了具有较好特异性、敏感性和稳定性的间接ELISA检测方法,并通过方阵试验,确立了最佳工作条件。确定其抗原最佳包被浓度为9.6μg/ml;抗原在4℃、包被24h, 37℃、封闭3h时效果最好;酶标二抗的最佳稀释度为1∶800 ,最佳作用时间为60min;抗原抗体最佳作用时间为60min。利用纯化抗体经生物素标记,可同辣根过氧化酶标记的亲和素特异结合的原理,建立了双抗体夹心ELISA法。采用纯化的抗体包被96孔板,形成固相抗体。加入不同浓度的己烯雌酚标准品后,再加入生物素标记抗体,以辣根过氧化物酶标记亲和素作为探针,经酶底物显色反应可获得良好的ELISA标准曲线。该方法操作简便、灵敏度高、特异性强,不需特殊设备,检测灵敏度为0.125ng/ml,可定量检测范围为0.25~15.60ng/ml,可满足实践中一般样品的残留检测。本研究还用建立的双抗体夹心ELISA方法对饲料样品中的DES残留进行了检测,并用购买的己烯雌酚残留检测试剂盒作对照。试验采用振摇与超声结合的方法提取饲料样品中的己烯雌酚,然后采用液液萃取和pH调