[目的]通过研究恒古骨伤愈合剂对于体外培养的人骨髓间充质干细胞的影响,来探寻恒古骨伤愈合剂治疗骨质疏松及骨质疏松性骨折的骨形成机制。同时,研究恒古骨伤愈合剂直接作用于人骨髓间充质干细胞的最适浓度,以及体外恒古骨伤愈合剂诱导人骨髓间充质干细胞分化情况。为进一步研究恒古骨伤愈合剂促进骨质疏松及骨质疏松性骨折骨形成机制作铺垫。[方法]立成熟的人骨髓间充质干细胞细胞系,稳定传代后给予恒古骨伤愈合剂诱导。<1>.首先筛选恒古骨伤愈合剂细胞层面诱导人骨髓间充质干细胞的最适稀释剂量,观察不同浓度恒古骨伤愈合剂作用于人骨髓间充质干细胞后,人骨髓间充质干细胞的生长、增殖情况。<2>.同时设置空白对照组(只加入培养基)、阳性对照组(1-34 PTH)、实验组(加入最适浓度恒古骨伤愈合剂),培养6d’并绘制细胞生长、增殖曲线。<3>.根据诱导后骨髓间充质干细胞的生长、增殖情况,持续诱导3周、4周后,观察人骨髓间充质干细胞分化情况。人骨髓间充质干细胞具有多重分化、潜在分化的能力,可向有利于骨质疏松及骨质疏松性骨折骨形成方向的细胞--成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞分化。使用常规染色的方法(茜素红染色成骨细胞、油红O染色脂肪细胞、阿辛蓝染色成软骨细胞)、免疫细胞组织化学的方法对恒古骨伤愈合剂诱导人骨髓间充质干细胞的分化情况进行定性的研究。[结果]实验结果显示:<1>.正常浓度的恒古骨伤愈合剂稀释16倍时,其刺激人骨髓间充质干细胞的的生长、增殖效果最为明显,且具有统计学差异(P=0.032,<0.05)。稀释浓度过小的恒古骨伤愈合剂加入细胞培养过程,会抑制人骨髓间充质干细胞的生长、增殖,并导致人骨髓间充质干细胞的死亡;稀释浓度大于16倍的恒古骨伤愈合剂作用于人骨髓间充质干细胞后,增殖效果较稀释16倍的恒古骨伤愈合剂减弱,但总体表现仍为促进增殖。<2>.人骨髓间充质干细胞的生长、增殖曲线表明,培养24h后,已加入16倍稀释恒古骨伤愈合剂孔和1-34甲状旁腺激素孔的人骨髓间充质干细胞数量低于对照组人骨髓间充质干细胞数量;在培养24-48h期间,恒古组和PTH组细胞大量增殖,远高于对照组未给药hBMSC细胞的数量;培养3d后,恒古组细胞增殖速度下降,PTH组细胞数量无明显增殖,恒古组细胞数量高于PTH组细胞数量。培养5天后,恒古组细胞数量开始被对照组细胞数量超过。<3>.光镜下hBMSC正常形态细胞呈长梭形,分布较均匀,平行排列呈螺旋状或旋涡状,细胞核清晰,核浆透明度高。稀释16倍恒古骨伤愈合剂连续诱导4周后,茜素红染色未出现明显嗜碱性成骨细胞,肉眼未见明显矿化结节;油红0染色后视野内可见大量透光小圆粒(脂肪小泡),富含光面内质网,脂肪细胞大量增生;阿辛蓝染色后,细胞骨架蓝染,但未见明显椭圆形、较小的软骨细胞。荧光显微镜下观察,阴性对照组只有细胞核蓝染,细胞骨架未特异性显示;稀释16倍恒古骨伤愈合剂诱导hBMSC四周后免疫荧光染色,可见大量成骨细胞骨架被红色荧光标记;单个成骨细胞呈梭型,细胞骨架清晰可见,胞质丰富,细胞核大而蓝染;脂肪细胞特异性免疫荧光染色,大量细胞特异性着色,细胞骨架和细胞核清晰可见,偶尔可见透亮、圆形、较小的未着色区域(脂滴空泡);未发现特异性着色的成软骨细胞。[结论]<1>.体外培养人骨髓间充质干细胞稳定传代后,加入稀释16倍的恒古骨伤愈合剂可以促进人骨髓间充质干细胞生长、增殖;<2>.恒古骨伤愈合剂诱导人骨髓间充质干细胞3周后,可以促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化、成脂肪细胞分化;4周后分化情况更为明显;但是人骨髓间充质干细胞未表现出向成软骨细胞方向分化。