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转化生长因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)是一种具有多种功能的细胞因子,TGF-β信号传导途径可介导多种上皮细胞生长抑制效应,调控细胞的生长、分化、凋亡、迁移及细胞外基质的形成,并且与肿瘤的发生、发展有密切关系。该信号传导通路由配体(TGF-β等)、受体(包括II型受体TGFBR2及I型受体TGFBR1)、Smads蛋白、转录调节的靶基因等组成。目前已证实,肿瘤细胞逃避TGF-β负调控的常见机制之一是TGF-β受体表达受抑制。TGFBR2是TGF-β信号的直接接受者,TGF-β首先与细胞膜上的TGFBR2结合,以启动下游通路,该受体在调控TGF-β诱导的细胞捕获和凋亡中发挥重要作用。在多种恶性肿瘤细胞中,包括非小细胞肺癌(NSCLC),TGFBR2等蛋白的异常表达可导致TGF-β信号传导紊乱,使细胞生长分化失去控制,从而促进了癌症的发生与发展。然而,虽然在NSCLC中TGFBR2的表达常有改变,但其编码区域的突变却非常少见。该受体表达的改变是由于基因突变等遗传因素改变引起,还是由于表观遗传因素所致,目前尚无定论。这促使我们对TGFBR2的编码区域进行突变检测,并进一步研究检测到的TGFBR2突变对TGF-β信号传导通路的影响和在NSCLC发生中的作用,以及探讨TGFBR2的表达改变与临床病理因素的关系。第一部分非小细胞肺癌TGFBR2基因的突变检测目的:1、检测各类型肺癌细胞和NSCLC组织中TGFBR2的编码区域突变情况。2、检测新发现的GCC(肺巨细胞癌)细胞TGFBR2纯合突变对其mRNA和蛋白表达的影响。方法:1、对17株各类型肺癌细胞、2株正常人胚肺成纤维细胞、115对NSCLC组织及其相应的正常肺组织(对照组),用PCR-DGGE(多聚酶链式反应-变性梯度凝胶电泳)及直接测序法,进行TGFBR2全部7个外显子基因突变检测:(1)用蛋白酶K消化和酚-氯仿法抽提样本的基因组DNA;(2)用PCR-DGGE检测样本TGFBR2基因的全部7个外显子;(3)纯化PCR产物及直接测序法进行基因测序分析。2、用RT-PCR的方法检测突变GCC细胞的mRNA:用TRIzol试剂抽提总RNA,用SUPERSCRIPTTM II RNase HˉReverse Transcriptase Kit逆转录成cDNA;设计两套引物分别扩增TGFBR2 1-4号外显子和4-7号外显子,GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)cDNA作为内参照;8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物大小。3、采用免疫共沉淀和Western blotting方法检测含有截断突变(c.492507del)的GCC细胞TGFBR2蛋白大小,并用细胞免疫荧光染色法观察其在细胞上的表达。Western blotting一抗为鼠抗人TGFBR2细胞外区域单克隆抗体,二抗为HRP标记的羊抗鼠抗体;细胞免疫荧光染色一抗同前,二抗为FITC标记的羊抗鼠抗体。结果:1、在两株来源于同一GCC母细胞系的细胞95D和PG中发现了TGFBR2一种新的纯合截断突变(c.492507del),并且在其相应的肺癌组织中得到证实。另外,在该患者其他组织(肝、肾等)以及其他15例GCC和LCC(大细胞癌)患者肺癌组织中发现种系杂合型截断突变(c.492507del),其突变率分别为2/2 GCC和7/13 LCC,而在100例其他类型NSCLC(包括腺癌、鳞癌和腺鳞癌)及所有正常对照细胞和组织中未发现上述突变。2、正常人胚肺成纤维细胞HFL1的TGFBR2外显子RT-PCR扩增产物分别为717 bp和805 bp,而突变GCC细胞扩增产物分别为701 bp和805 bp;3、Western blotting显示HFL1细胞TGFBR2蛋白为全长,而GCC细胞为截断蛋白。细胞免疫荧光染色显示突变的TGFBR2蛋白仍能在细胞膜上表达。结论:1、新发现的TGFBR2截断突变(c.492507del)只存在于GCC细胞和GCC、LCC组织中,基因突变造成TGFBR2的失活可能在GCC和LCC的发病机制中起重要作用。2、缺失16 bp的TGFBR2截断突变没有影响到mRNA的转录和剪切,但导致翻译时提前出现终止密码子,产生TGFBR2截断蛋白。3、TGFBR2突变产生的截断蛋白细胞外区完整,发生改变的跨膜区并未使蛋白从细胞表面释放,蛋白仍能在胞膜上表达。第二部分TGFBR2截断突变对TGF-β信号传导通路的影响目的:验证GCC细胞的TGFBR2截断突变在TGF-β信号传导通路失活中起了重要作用。方法:1、突变细胞对外源性TGF-β1刺激的敏感性试验:(1)生长抑制试验:用不同浓度(0, 0.2, 1, 5 ng/ml)的外源性TGF-β1刺激突变细胞,用MTS比色法进行细胞计数来评价细胞的生长状况,确定TGF-β1对突变细胞有无生长抑制效应,TGF-β1浓度为5 ng/ml时细胞增殖降低40%,认为对TGF-β1敏感;(2)外源性TGF-β1对突变细胞纤连蛋白(FN)的mRNA表达的影响:对携带有突变的GCC细胞分别施加TGF-β1浓度为0和5 ng/ml的无血清培养液,培养48 hr后,用实时定量PCR和△△Ct法检测TGF-β1处理前后FN的mRNA相对表达量变化,内参照基因为GAPDH。2、野生型TGFBR2基因转染及TGF-β1诱导的转录激活效应检测:将携带野生型TGFBR2基因的质粒pcDNA3-TGFBR2(或空质粒pcDNA3)和TGF-β诱导的萤光素酶报告质粒p3TP-lux共同转染突变细胞,再以含5 ng/ml TGF-β1的培养液或不含TGF-β1的培养液处理细胞,观测在外源性TGF-β1作用前后细胞裂解液萤光素酶相对活性的变化,以检测突变细胞在转染了野生型TGFBR2基因后,是否恢复了对TGF-β1的敏感性。Renilla萤光素酶报告基因pRL-SV40作为内对照报告基因,瞬时共同转染培养细胞,校正不同的转染效率。用Berthold Lumat LB 9507化学发光检测仪测定萤光素酶活性。结果:1、突变的GCC细胞失去了对TGF-β1的敏感性,在外源性TGF-β1作用下,突变细胞未能显示出TGF-β1的生长抑制效应和促细胞外基质合成的作用。2、当突变细胞转染了野生型TGFBR2基因后,细胞恢复了对TGF-β1的敏感性。结论:GCC细胞中的TGFBR2突变在TGF-β信号传导通路失活中起了重要作用。第三部分TGFBR2在NSCLC中的表达及其临床病理意义目的:1、检测TGFBR2蛋白在LCC(包括GCC)和非LCC(包括腺癌、鳞癌和腺鳞癌)中的表达,分析其表达的高低与NSCLC的发生的相关性及与病理类型、患者年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期等的关系。2、分析LCC中TGFBR2表达与截断突变(c.492507del)的关系。方法:取115对NSCLC样本(癌组织及其相应的正常肺组织)以及1例人正常细支气管样本(阳性对照)分别制成90点、90点和53点的三块组织芯片,用组织免疫化学方法(两步法)检测TGFBR2蛋白在NSCLC各病理类型中的表达。石蜡切片常规脱蜡和脱水,3%H2O2阻断内源性过氧化物酶,0.01M柠檬酸盐缓冲液(PH 6.0)中煮沸20 min抗原修复,滴加封闭用正常羊血清封闭,加一抗(鼠抗人TGFBR2单克隆抗体)室温湿盒中孵育,加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠/兔二抗,DAB显色,同时以PBS代替一抗设立阴性对照,人正常细支气管作为阳性对照。染色结果判定标准:阳性信号呈棕黄色颗粒状,定位于细胞膜和胞浆。先根据肿瘤细胞染色强度分为四级:0(未着色);1(浅染);2(较深);3(深染);再根据肿瘤细胞着色分布(阳性细胞占肿瘤细胞的百分比)分为四级:0(0~25%细胞着色);1(26~50%细胞着色);2(51~75%细胞着色);3(76~100%细胞着色)。最终结果为两者的乘积,0为表达缺失(阴性表达),1~9为阳性表达,如癌组织评分等于其对照组织,认为是表达正常,如低于其对照组织,认为是表达下调。结果:1、对照组115例正常肺泡上皮和细支气管上皮细胞均为全部细胞强染色,评分为9分;而在115例肺癌标本中,表达缺失2例(1.7%),其余113例为阳性表达。表达缺失或下调占47.8%(55/115),表达正常52.2%(60/115),TGFBR2在NSCLC与正常对照组织中的表达差别显著(P<0.0001)。其中,腺癌、鳞癌、腺鳞癌表达下调分别占其总数的44%(22/50)、43.2%(19/44)和33.3%(2/6),而大细胞癌表达下调高达80.0%(12/15),有别于其他病理类型(P<0.05)。2、TGFBR2的异常表达与患者年龄、性别、肿瘤大小和局部侵袭(T)、淋巴结侵袭(N)、转移(M)、临床分期在统计学上无差异。2、突变型和野生型LCC在TGFBR2表达上的差别也无统计学意义。结论:1、TGFBR2在NSCLC与正常对照组织中的表达差别显著,提示TGFBR2的表达下调可能与NSCLC的发生或发展相关。2、在TGFBR2表达水平上,LCC与非LCC差别也有显著的统计学意义。3、LCC的TGFBR2表达下调与其截断突变并无关系。4、TGFBR2在NSCLC的表达变化与患者年龄、性别、肿瘤大小和局部侵袭(T)、淋巴结侵袭(N)、转移(M)、临床分期在统计学上无差别。全文总结1、在两株来源于同一GCC母细胞系的肺癌细胞95D和PG中发现了TGFBR2一种新的纯合截断突变(c.492507del),并且在该患者相应的肺癌组织中得到证实。另外,在该患者的肝、肾等组织以及其他15例GCC和LCC患者肺癌组织中发现有种系杂合型截断突变(c.492507del),而在100例其他类型NSCLC(包括腺癌、鳞癌和腺鳞癌)中未发现上述突变,所有正常对照细胞和组织中也未发现该突变。2、GCC细胞TGFBR2的16 bp的纯合截断突变(c.492507del)导致在cDNA的第590-592核苷酸过早形成终止密码子,使翻译提前终止于紧随跨膜区后的位置,所产生的TGFBR2截断蛋白只含有191个氨基酸残基,其细胞外区完整,跨膜区发生改变,胞质激酶区丧失,导致携有纯合突变的细胞失去对TGF-β的敏感性。突变细胞转染野生型TGFBR2基因后,TGF-β信号传导通路得以恢复。3、NSCLC与正常对照组织中TGFBR2的表达差别显著,提示TGFBR2的表达下调可能与NSCLC的发生或发展相关。TGFBR2的表达异常与病理类型有关,LCC与非LCC的表达水平有显著差别,但LCC的TGFBR2表达下调与其截断突变并无关系。TGFBR2的表达变化与患者年龄、性别、肿瘤大小和局部侵袭(T)、淋巴结侵袭(N)、转移(M)、临床分期在统计学上无差别。4、作为抑癌基因,TGFBR2的截断突变和表达下调共同使TGF-β信号传导通路失活,导致相应的细胞失去生长抑制并促进肿瘤形成。以往的LCC(包括GCC)与非LCC区分是依靠表型来决定的,我们的研究为区分LCC与非LCC提供了基因型和表达上的证据。LCC不仅在分化程度上,而且在TGFBR2的基因突变和表达上都与腺癌和鳞癌等其他类型NSCLC有所不同。