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目的非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)包括初始阶段单纯的脂肪变性到发展阶段的更为严重的脂肪性肝炎,最终可能发展为肝硬化甚至肝癌。小窝蛋白1(Caveolin1,CAV1)支架蛋白具有内吞作用并能够维持体内脂质稳态,在自噬和肝能量代谢的调节中有重要的作用。然而,仍然不清楚CAV1能否通过调节自噬来影响肝脂质代谢。本研究旨在探讨CAV1在NAFLD中的作用并探讨其可能的分子机制,以期为以CAV1和自噬为靶点治疗NAFLD提供实验依据。方法1.体内实验使用CSD多肽代替CAV1,CSD多肽是CAV1 82-101位氨基酸序列的脚手架区结构域,可以调节CAV1与多种信号分子结合,CAV1的生物学功能可以通过CSD来实现。采用雄性C57小鼠,共分为3组,分别为正常饮食对照组(Control),高脂饮食(high-fat diet,HFD)模型组以及CSD治疗组。HE、油红O染色检测肝脏组织病理学结构变化,试剂盒检测血清学ALT、AST、TG水平的变化,透射电镜观察肝脏自噬小体和脂滴,Western blot检测CAV1、脂质代谢相关蛋白,自噬相关蛋白以及Akt/m TOR通路相关蛋白的表达。2.体外实验采用L02细胞株,用酒精和油酸钠制备混合因素脂肪变细胞模型,采用RNA干扰技术合成了CAV1-si RNA进行CAV1基因的沉默,采用全基因技术合成了GV146-CAV1进行CAV1基因的过表达,分别观察CAV1-si RNA和GV146-CAV1对脂质代谢和自噬水平的影响。在CAV1过表达质粒组中使用自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ),观察CQ能否逆转在脂肪变的L02细胞中CAV1过表达所导致的自噬以及脂质代谢的变化,验证CAV1调控脂质代谢是否与自噬有关。在CAV1-si RNA沉默组中使用m TOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA),观察RAPA能否逆转在脂肪变的L02细胞中CAV1沉默所导致的自噬以及脂质代谢的变化,验证CAV1调控脂质代谢及自噬是否与m TOR通路有关。结果1.体内实验结果蛋白结果显示,与对照组相比,高脂饮食模型组小鼠肝脏调控脂质合成基因SREBP-1表达显著增加,CAV1和自噬发生指标蛋白LC3和Beclin1表达显著减少,自噬的选择性底物p62表达显著增加。体外L02细胞中蛋白结果与体内保持一致,免疫荧光结果同样也表明CAV1在脂肪变L02细胞中表达水平也显著降低。结果表明NAFLD过程中,CAV1的表达显著降低并且自噬被抑制HE和油红O结果显示,HFD小鼠在CSD治疗后脂肪空泡的数目明显减少,炎性细胞浸润的程度明显减轻。同时CSD组小鼠血清ALT、AST、TG水平与模型组相比明显降低。透射电镜结果显示,HFD小鼠在CSD治疗后脂滴数量和受损的线粒体数量明显减少,而自噬小体的数量明显增加。蛋白结果显示,与模型组小鼠相比,CSD治疗组小鼠肝脏CAV1表达显著升高,自噬发生指标蛋LC3-II/I和Beclin1水平均显著升高,而p62水平显著降低。结果表明在NAFLD小鼠中过表达CAV1能够减轻脂质蓄积,促进自噬。2.体外实验结果L02细胞中,油红O结果显示,与阴性对照组相比,GV146-CAV1过表达组橘红色脂滴明显减少,而CAV1-si RNA沉默组橘红色脂滴明显增加。自噬相关蛋白结果显示GV146-CAV1能够显著升高模型组降低的自噬水平,CAV1-si RNA进一步抑制模型组的自噬。因此CAV1在脂肪变的L02细胞中能够促进自噬。并且自噬降解抑制剂CQ逆转了在脂肪变的L02细胞中CAV1过表达所减轻的脂质积累以及升高的自噬水平。因此CAV1减轻L02细胞的脂质积累与其促进自噬有关。Western blot结果显示,与模型组小鼠相比,CSD治疗组小鼠肝脏p-Akt与p-m TOR表达水平显著降低。在L02细胞中,CAV1的过表达质粒显著降低p-Akt与p-m TOR表达水平;CAV1-si RNA显著升高p-Akt与p-m TOR表达水平。并且m TOR抑制剂雷帕霉素逆转了脂肪变细胞中CAV1基因沉默所加重的脂质积累以及降低的自噬水平。上述结果表明CAV1能够减轻脂质沉积,促进脂肪变状态下细胞的自噬,可能是通过抑制Akt/m TOR通路发挥作用。结论1.CAV1在HFD小鼠肝脏和脂肪变L02细胞中表达显著减少。2.CAV1在NAFLD中能够减轻脂质沉积与其促进自噬有关,并且与其抑制Akt/m TOR通路有关。