论文部分内容阅读
干细胞是一类具有自我更新与分化潜能细胞类群,该特点决定了干细胞在生物个体的胚胎发育、造血再生、组织修复等多种生理过程中发挥重要作用。生殖干细胞作为干细胞家族的一员,在生殖器官的发育、生殖系统的稳态调节以及配子发生等过程中发挥重要作用。果蝇精巢生殖干细胞(Germline Stem Cells,GSCs)为探究干细胞维持与分化的调控机理提供了非常理想的研究模型。Gilgamesh(gish)基因编码一种丝氨酸/苏氨酸激酶,属于酪蛋白激酶I(Casein Kinase 1,CK1)家族,主要在神经细胞、生殖细胞以及肌肉胞中显著表达,Gish在神经胶质细胞迁移、精子发生过程以及嗅觉学习等过程中都发挥着重要功能。在雄性不育系果蝇的遗传学筛选过程中,我们发现,与同期的野生型果蝇相比,果蝇gish基因缺失突变体的精巢生殖干细胞数量出现严重缺失。以此为线索,本课题围绕gish基因调控精巢生殖干细胞维持这一科学问题进行了一系列研究。首先,采用免疫组织化学技术对果蝇精巢生殖干细胞(Germline Stem Cells,GSCs)进行标记,研究了野生型果蝇Oregon与三组gish基因突变体(gishKG03891/gish04895、gishKG03891/gishMI08417、gish04895/gishMI08417)果蝇的精巢GSCs在羽化后不同天数的数量。结果显示,野生型果蝇羽化后第1d、10d、20d精巢GSCs的平均数量分别为8.1个、7.7个、6.6个;而三组gish突变体羽化后在这三个时间点的GSCs的平均数目分别为6.5个、5.6个、3.7个。此结果表明,gish突变体精巢生殖干细胞的数目与野生型相比出现了严重缺失,故初步认定gish基因突变导致精巢生殖干细胞缺失。其次,依据果蝇数据库(www.Flybase.org)中提供的果蝇全基因组信息,合成引物,采用RT-PCR技术对果蝇精巢中gish不同转录本的编码序列进行克隆并测序;采用实时荧光定量PCR技术检测了gish不同转录本在果蝇精巢中的表达情况;构建了转基因载体并且进行显微注射。结果如下:(1)测序得到果蝇精巢中8条gish编码框的实际序列。(2)依据果蝇数据库,克隆所得的8条gish序列中,其中6种gish(B、E、F、I、K、L)拥有共同的翻译起始点,2种gish(A、C)拥有共同的翻译起始点。荧光定量PCR(q PCR)结果表明,6种gish(B、E、F、I、K、L)的表达水平显著高于2种gish(A、C)的表达水平(26倍)。此结果暗示了gishF等6种转录本在精巢GSCs的维持中承担重要的功能。(3)qPCR的结果也表明,与野生型相比,三组突变体gishKG03891/gish04895、gishKG03891/gishMI08417、gish04895/gishMI08417果蝇中gish基因的表达水平显著降低。其中,gishKG03891/gishMI08417突变体精巢中gish基因的表达量相对最低,该突变体的表型也是最强,gish基因相对表达量高低趋势与其突变体表型强弱吻合。(4)借助显微注射技术,获得gish转基因果蝇品系。此结果为下一步基因挽救试验奠定基础。再者,利用P{UASp-gishF}转基因果蝇品系,通过与P{NosP-gal4}工具株品系果蝇杂交,对突变体进行了表型挽救试验。统计结果显示,三组挽救组gish突变体羽化后第1d、10d、20d精巢GSCs的平均数量分别为7.0个、7.0个、5.8个,恢复到正常水平。遗传挽救试验及前期的表型统计结果充分表明,gish基因影响果蝇精巢生殖干细胞的维持。最后,研究了gish突变背景下bam与dad基因的表达模式。通过GFP抗体免疫荧光染色,bam与dad基因的表达模式与野生型无明显差异。该结果暗示了gish基因不是位于bam及dad基因的上游发挥作用,由此推测gish可能是位于bam与dad基因的下游或平行于BMP信号通路发挥功能。综上结果都表明,gish基因在维持果蝇精巢干细胞过程中发挥功能,但其具体调控机制以及与其它信号通路的关系还有待进一步研究。