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第一部分:EGFR shRNA表达载体的构建及鉴定目的:构建针对EGFR基因家族序列特异性的shRNA表达载体,为本课题下一步研究提供有力工具。方法:选择放疗不敏感的卵巢癌SKOV3细胞中高表达的EGFR基因为靶基因,根据siRNA的设计原则,设计针对EGFR基因序列的特异性表达载体(pGensil-1-E)及非特异性表达载体(pGensil-1-N)。体外合成两段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火,克隆到质粒载体pGensil-1的pol III启动子下游,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。结果:经酶切和DNA测序表明,成功构建了EGFR家族同源性基因的表达载体,pGensil-1-E及pGensil-1-N。结论:本实验成功构建了针对EGFR家族同源性基因的表达载体。第二部分RNAi沉默EGFR基因对卵巢癌移植瘤放疗敏感性的影响目的:应用RNAi技术,将序列特异性的EGFR shRNA表达载体转染卵巢癌移植瘤,观察EGFR基因对卵巢癌放疗敏感性的影响。方法:应用卵巢癌SKOV3细胞建立裸鼠移植瘤模型,随机分为对照组、单纯放疗组、放疗+pGenesil-1-E组,采用6MV X线照射裸鼠瘤组织,监测三组瘤体积,治疗后测量瘤质量,取瘤组织行RT-PCR、Western Blot、免疫组化、电镜检测。结果:治疗后三组肿瘤体积差异均有统计学意义(P<0.01),单纯放疗组、放疗+pGenesil-1-E组的抑瘤率分别为28.1%、46.1%;放疗+pGenesil-1-E组EGFR基因的表达明显下调,透射电镜下瘤组织调亡.坏死最明显。结论:动物实验证实RNAi沉默EGFR基因明显提高卵巢癌的放疗敏感性,为卵巢癌的基因放疗提供一定的实验依据。