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细菌分泌系统是细菌依赖分泌通路进行蛋白质的跨胞浆膜转运的系统,而依赖分泌系统分泌的蛋白或蛋白性质的毒力因子往往与细菌的生存、繁殖、和扩散紧密相关。目前,在革兰氏阴性细菌中,已经发现了6大类分泌系统。Ⅵ型分泌系统（typeⅥsecretion system,T6SS）是革兰氏阴性菌中新发现的一类分泌系统,在细菌与寄主的相互作用中发挥重要作用。由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa）引起的猕猴桃细菌性溃疡病已成为世界上猕猴桃的毁灭性病害,可危害枝干、叶片、花引起枝干溃疡、叶斑和花腐,频繁导致枝枯、树死、绝收,经济损失巨大。因此,尽早揭示Psa致病机理对病害高效持久的防控策略制定和防控技术研发具有重要意义。本实验室在前期进行了猕猴桃细菌性溃疡病的流行规律及防治研究,Psa种类及群体结构、侵染致病过程及其机理研究,从Psa群体中筛选获得一株强致病力菌株M228,本研究以该菌株为材料,拟揭示T6SS在Psa致病过程中的作用。通过获得结构基因tss C、tss M和tss J缺失突变体,从致病力、与寄主互作的组织细胞学、T6SS的活性、生物学特性、对Ⅲ型分泌系统（typeⅢsecretion system,T3SS）相关基因表达的影响等方面对T6SS的三个结构基因tss C、tss M、tss J的致病功能展开研究。主要研究结果如下:1. 应用同源重组的方法,构建了三个基因的缺失突变体M228?tss C、M228?tss M和M228?tss J;此外,利用电转技术,在三个缺失突变体内电转目标基因获得了对应的回复突变体M228?tss C-C、M228?tss M-C和M228?tss J-C。为后续研究三个基因的致病功能提供了试验材料。2. 为研究三个基因对M228致病力的影响,分别测定了所有突变体和野生型菌株在寄主枝条和叶片上的致病力。枝条与叶片致病力测定结果一致,M228?tss J、M228?tss C和M228?tss M三个突变体较野生型菌株M228致病力显著下降,下降程度分别为92.5%、94.4%和92.5%,而三个回复突变体的致病力均恢复至野生型相近的水平,研究结果表明三个基因的缺失会引起M228的致病力显著下降。为了进一步研究导致其致病力下降的原因,本研究从微观的水平对发病寄主叶片的组织进行了组织细胞学观察。观察结果显示:在接种野生型菌株M228 4天后,在寄主组织内观察到了大量的细菌,并引起寄主细胞严重的质壁分离,细胞壁电子致密度下降以及细胞器如叶绿体、线粒体的降解,同时受侵染的寄主细胞原生质紊乱;但在接种三个缺失突变株后,第4天在宿主组织中仅发现少量细菌定殖,且寄主细胞完好无损,细胞器也没有明显降解,表明其定殖和侵染能力较野生型菌株M228明显下降;而这三个回复突变体可引起与野生型菌株相似的寄主细胞现象,表明其定殖和侵染能力已恢复至野生型水平。3. 依赖于T6SS分泌的Hcp蛋白（hemolysin co-regulatory protein）是T6SS活性检测的可靠指标（Pukatzki et al.2009）。因此,本研究通过构建Hcp蛋白连接VSV-G标签的表达载体,并将表达载体电转进入M228以及各个突变体中,分别提取各菌株的外泌蛋白以及胞内蛋白,然后利用western blot杂交技术来分析基因tss C、tss M和tss J的缺失是否影响了T6SS的活性。试验结果显示只有tss M和tss J基因敲除之后T6SS的活性受到影响,这表明基因tss M和tss J是T6SS发挥活性所必需的。为进一步的研究三个基因的功能及其突变体致病力下降的原因,本研究对所有突变体和野生型菌株的生长曲线、生物膜形成能力和对金属离子的耐受性等生物学特性进行了测定。试验结果显示:与野生型菌株M228相比,M228?tss C与M228?tss M在生长过程中的对数期和平台期都较野生型菌株出现的略晚;M228?tss J与M228?tss M在后期对硫酸铜的耐受性明显的升高;三个缺失突变体的生物膜形成能力、对过氧化氢（H2O2）的耐受性以及水解胞外蛋白的能力较M228均显著下降,然而其产胞外多糖的能力、运动性以及对3%氯化钠（w/v）的耐受性较M228均没有明显的变化,而三个回复突变体的所有这些性质均被恢复到与野生型菌株M228相同的水平。以上研究结果表明三个基因对菌株M228的生物膜形成能力、对过氧化氢（H2O2）的耐受性、对铜离子的耐受性以及水解胞外蛋白的能力均有显著的影响,这些因素可能与其突变体的致病力下降有着密切的联系。4. 为研究三个基因对T3SS相关基因表达的影响,本研究使用q RT-PCR技术分析三个缺失突变体T3SS相关基因hrp R、hrp L、hrp Z、hrc C、hop M1、hop H1、hop P1的表达量变化。试验结果显示,与野生型菌株M228相比,M228?tss C和M228?tss M的T3SS相关基因的表达量显著下调,而M228?tss J的T3SS相关基因的表达量显著上调,这表明在菌株M228中T6SS和T3SS间存在着复杂的调控关系。为进一步研究突变体M228?tss C和M228?tss M致病力下降与其T3SS相关基因表达的关系,本研究在突变体M228?tss C和M228?tss M中过表达T3SS转录调控基因hrp L和hrp R,并测定其致病力,结果发现,T3SS的调控基因hrp L和hrp R过表达之后对突变体的致病力没有显著的影响,由此表明两个突变体的T3SS相关基因表达量的变化并不是引起其致病力下降的关键因素。