榄香烯抗喉癌作用的实验研究一、实验目的喉癌是耳鼻咽喉头颈外科常见的恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的1％～5％，在耳鼻咽喉恶性肿瘤中占第三位。我国北方是相对高发地区。目前喉癌的治疗实行综合治疗即根据肿瘤的生物学行为，通过手术、放疗、化疗、生物治疗、中医等手段的合理应用，达到最大程度消灭肿瘤、保留喉功能、提高患者生存率和生存质量的目的。近来临床研究证明，对于局部进展期的喉鳞癌使用新辅助化疗即诱导化疗可增加局部控制率，使用同步化放疗有利于保留喉的功能，减少肿瘤转移和提高患者的生存质量。目前化疗多采用含铂类的化疗方案，常有一定的副作用，造成骨髓抑制、肝肾毒性、感染、胃肠反应、甚至死亡等。所以寻找高效、低毒的化疗药物是亟待解决的问题。实验药理学研究证实榄香烯对体内外多种肿瘤细胞具有较强的抑制和杀伤效应。临床研究也发现榄香烯对多种肿瘤有确切疗效，呈现广谱的抗肿瘤特点。榄香烯不但有直接抗肿瘤作用，而且还有免疫保护作用、与放疗化疗有协同作用，能缓解癌性疼痛、升高白细胞和抑制血小板聚集等作用。相对于大多数化疗药物而言，该药毒副作用小，无明显肝肾功能损害，不发生骨髓抑制，长期使用无耐药性产生。但其抗人喉鳞癌作用机制及地位如何，尚在探讨之中。Ki67是一种与增殖细胞相关的核抗原，是近年来研究最多、最具有前途的细胞增生标记。VEGF-C与其配体VEGFR-3结合，调节肿瘤血管新生以及淋巴管生成，促进肿瘤细胞进入淋巴管，在肿瘤生长和转移的不同阶段都具有重要的作用。本研究主要通过体内外实验观察榄香烯对喉癌的治疗作用，通过免疫组化和逆转录PCR技术检测Ki67、VEGF-C和VEGFR-3的表达，探讨榄香烯治疗喉癌的机理。二、实验材料和方法（一）实验材料喉鳞癌Hep-2细胞株购自上海中国科学院细胞库。榄香烯乳100mg/20ml（批号：H10960114）购自大连金港制药公司。BALB/c-nu裸鼠40只，购自上海中国科学院实验动物中心，5-6周龄，雌雄各半，体重19.28-22.668g，平均为21.27±0.80g。无特定病原体（Specific pathogen Free，SPF）条件饲养，保持一定湿度、温度（25-28℃）。（二）实验方法1、细胞培养和药物毒性实验：体外培养人喉癌Hep-2细胞，分别以浓度为0（对照）、10、20、30……和120μg/ml的榄香烯处理24小时，应用MTT比色法测定不同浓度榄香烯对Hep-2细胞增殖的影响，并绘制剂量-效应曲线；通过透射电镜观察检测细胞凋亡；采用PI单染法用流式细胞仪检测喉癌细胞的凋亡率，测定细胞周期。2、建立移植瘤模型，进行药物干预：每只裸鼠于右耳后下皮下注射1×109个/L喉癌Hep-2细胞悬液0.2ml，待肿瘤生长25天，至直径＞1cm时，将40只裸鼠抽签法随机化平均分为两组，任意选取其中一组作为治疗组，治疗前称重，测量瘤体大小，经检验两组动物的体重和瘤体积在处理前差异无统计学意义。两组动物每3天腹腔给药1次，同时测量肿瘤大小，计算肿瘤体积。每次注射榄香烯120mg/kg，对照组给予同等量PBS液，共给药8次。停药后3天，处死裸鼠，剥离肿瘤，称量瘤重和鼠重，测量肿瘤长、短径，并计算肿瘤体积和抑瘤率。快速将每一例肿瘤组织分为两份，一份-80℃冰箱保存。另一份10％甲醛固定。3、免疫组化SP法检测Ki67、VEGF-C和VEGFR-3的蛋白表达：兔抗人VEGF-C多克隆抗体（rabbit anti-VEGF-C），编号：ZA-0266；兔抗人VEGFR-3多克隆抗体（rabbit anti-VEGFR-3），编号：ZA-0267；兔抗人ki-67单克隆抗体（rabbit anti-nuclear antigen monoclonal antibody），编号：ZA-0502。一抗，SP-900(Histosain^TM-plus kits和DAB显色试剂盒均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。实验步骤按试剂盒说明书进行。阳性对照由厂家提供，用PBS代替一抗作为阴性对照。Ki67以细胞核出现棕黄色染色为阳性；VEGF-C蛋白阳性表达为棕黄色染色，主要存在于细胞浆；VEGFR-3将脉管内皮细胞胞浆染成棕黄色，脉管计数按照Weidner报道的方法。4、逆转录PCR检测VEGF-C和VEGFR-3基因表达：取50-100mg移植瘤组织加人1ml TriPure溶液彻底匀浆。按TriPure试剂盒说明书用一步法提取总RNA，用DNA/RNA测定仪测定RNA浓度和纯度。逆转录反应合成cDNA。VEGF-C、VEGFR-3和GAPDH引物由Invitrogen Biotechnology Co．合成。特异引物序列分别为：VEGF-C （592bp）:sense: 5’-AGTTTTGCCAATTCACACTTCCTG-3’,antisense: 5’-GTCATTGGCAGAAAACCAGTCTT-3’;VEGFR-3（298bp）:sense: 5’-AGCCATTCATCAACAAGCCT-3’,antisense: 5’-GGCAACAGCTGGATGTCATA-3’;GAPDH （188bp）sense: 5’-AATCCATGGCACCGTCAAGGCT-3’,antisense: 5’-TCAGGTCCACCACTGACACGTT-3’;在PCR反应体系中含有：3μlcDNA、2.5mMdNTP2μl、10×PCR缓冲液2.5μl、灭菌蒸馏水16.7μl、Ex Taq 0.2μl、上下游引物各0.5μ1，下游引物0.1μl。反应条件：94℃变性3min；94℃1min、55℃1min30sec、72℃2min，30个循环；72℃7min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭显色。用UVP-8000凝胶成像分析仪进行摄像分析。用DL2000 DNA Marker作为分子大小对照确定阳性琼脂糖凝胶电泳条带。使用Band Leader Ver．3.0图像分析软件对电泳条带进行灰度扫描，计算VEGF-C、VEGFR-3与GAPDH产物条带的灰度值比值，即得到VEGF-C和VEGFR-3表达的相对值。5、统计学分析用SPSS13.0软件完成，计数资料采用X²检验，计量资料采用t检验及单因素方差分析，相关性采用Spearman相关分析。结果1、MTT实验结果：榄香烯对Hep-2细胞增殖抑制程度与药物浓度之间呈直线关系，经直线回归，榄香烯作用24小时对Hep-2细胞的半数生长抑制浓度IC₅₀为62.70μg/ml。2、流式细胞分析结果：在没有药物干预时Hep-2细胞以Q₀G₁期细胞为主，占67.7％，也存在少量凋亡细胞，占3.41％。随着作用药物浓度的增加或作用时间的延长凋亡细胞数增加，G₂M期细胞增加，G₀G₁期细胞减少（P＜0.01）。3、透射电镜结果：实验组细胞核染色质发生边集，固缩，在细胞核膜周边聚集形成新月体形或花瓣形，电子密度增强，具有凋亡细胞的特点。4、移植瘤生长状况：40只人喉癌裸鼠移植瘤模型建立成功，5天后可见皮下肿瘤形成，并随病期延长不断长大。榄香烯治疗的实验组裸鼠状态良好，体重无明显减轻，移植瘤生长缓慢、停滞；对照组裸鼠状态差，渐消瘦，呈恶病质状态，移植瘤呈结节状，生长快，体积明显比对照组大。从治疗第7天开始两组间肿瘤体积差异具有显著性统计学意义，P＜0.01。在榄香烯治疗期间两组动物均无死亡。榄香烯能明显抑制喉癌的生长，抑瘤率为52.24％，在实验组和对照组之间，鼠净重、瘤重和瘤体积，经t检验P值均＜0.01，差异具有显著性统计学意义。5、病理学观察：HE染色，光镜下可见对照组肿瘤细胞核大浓染，细胞分裂象多见，坏死区少见；实验组肿瘤细胞小，组织中细胞坏死程度、坏死灶周围纤维化程度明显比对照组高。6、免疫组化结果：实验组移植瘤KI指数为28.88±3.15，对照组为78.18±4.51；实验组移植瘤VEGF-C蛋白表达积分为15.82±2.05，对照组为113.61±16.29；实验组VEGFR-3阳性脉管密度的平均值为7.02±0.59，对照组为19.84±1.89；实验组和对照组KI指数、VEGF-C蛋白表达积分和VEGFR-3阳性脉管密度之间差异具有显著性统计学意义，P＜0.01。7、RT-PCR结果：实验组VEGF-C和VEGFR-3mRNA表达相对值分别为1.0018±0.0842和0.9697±0.251；对照组VEGF-C和VEGFR-3mRNA表达相对值分别为1.6313±0.0294和1.3631±0.1346；实验组和对照组VEGF-C和VEGFR-3mRNA表达相对值之间的差异具有显著性统计学意义，P＜0.01。四、结论在体外：榄香烯对人喉癌Hep-2细胞增殖具有明显抑制作用；榄香烯抑制人喉癌Hep-2细胞增殖与榄香烯诱导Hep-2细胞凋亡和干扰Hep-2细胞周期有关，榄香烯阻滞Hep-2细胞于G₂M期。在裸鼠体内：榄香烯能显著抑制人喉鳞癌移植瘤的生长，治疗效果显著，无明显毒副作用；榄香烯能明显下调Ki67的表达，Ki67表达下调是榄香烯抑制喉癌生长的机制之一；榄香烯在蛋白水平和基因水平均能抑制VEGF-C和VEGFR-3的表达，下调VEGF-C、VEGFR-3的表达和抑制喉癌的脉管生成是榄香烯抑制喉癌生长的另一重要机制。