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目的:自噬是一种高度保守的细胞行为,它能够降解胞内的毒害物质、大分子以及细胞器来维护细胞稳态。自噬在肿瘤发生发展中具有“双刃剑”的作用,即同时具有抑制和促进两种功能。一方面,自噬可以维护正常细胞内的基因组稳定性阻止细胞癌变。另一方面,自噬可为肿瘤细胞提供能量代谢维持细胞存活。很多研究表明,与正常组织相比,肿瘤组织自噬相关基因表达量存在明显差异,且其表达程度与肿瘤的TNM分期、转移、复发等相关。因此,自噬相关基因被广泛关注,针对自噬不但可以为抗癌药物提供新的靶点,自噬相关基因也能作为肿瘤的预后指标。乳腺癌是世界范围内女性健康的头号威胁,随着我国经济的飞速发展,人民生活习惯、饮食结构和生育方式的改变,国内女性的乳腺癌发病率呈逐年上升趋势。乳腺癌是一种高度异质性的疾病,根据乳腺癌分子标志物雌激素受体、孕激素受体和上皮生长因子受体表达的差异可划分为多个分子分型。三阴型乳腺癌缺失上述三种分子标志物,占全部乳腺癌的15~20%,术后多年仍能复发并伴随癌症远端转移,是预后最差的乳腺癌分型。因此,寻找三阴型乳腺癌的分子标志物和预后指标具有重大意义。自噬相关基因7(Atg7)是一类泛素化激活酶,在自噬膜延伸过程中发挥重要作用,是自噬过程不可缺少的组件。Atg7缺失的小鼠因缺少自噬功能死于出生后呼吸窘迫。在许多癌症中如肺癌、肝癌、前列腺癌中Atg7都发挥重要功能并且有望成为临床治疗的靶点。近年来有研究报导,Atg7在乳腺癌中高表达,Atg7个别点位的核酸多态性与三阴型乳腺癌预后相关;在乳腺癌细胞中沉默Atg7再联合紫杉醇药物提升了药物敏感性并促进了细胞凋亡。上述研究提示Atg7在乳腺癌中具有重要功能,本课题将以乳腺癌组织和乳腺癌细胞为实验对象,主要通过免疫组化揭示Atg7的表达与患者临床指标和预后的相关性。其次,通过乳腺癌细胞为模型,验证Atg7在乳腺癌中的功能,意在为乳腺癌临床提供新的预后指标和潜在治疗靶点。方法:1.通过Kaplan-Meier Plotter软件对TCGA数据库中乳腺癌组织的Atg7 mRNA表达水平与预后的相关性进行分析并绘制生存曲线。选取90例各个分子分型的乳腺癌患者组织切片进行免疫组化染色来探寻Atg7蛋白的表达情况,并进行统计分析。2.选取164点的三阴型乳腺癌组织芯片进行免疫组化,采用Pearsonχ~2检验及adjusted logistic回归的方法统计分析Atg7表达与患者年龄、肿瘤尺寸、Ki-67水平、组织学分级、TNM分期以及转移与否的相关性。选取42例2009至2013年期间术后的三阴型乳腺癌患者的组织进行免疫组化,进一步采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,并采用对数秩检验(Log-rank)检验确定中位生存时间,最后采用校正多因素Cox生存回归分析Atg7表达水平与三阴性乳腺癌患者预后的相关性。3.通过Western Blot检测Atg7蛋白在不同分子分型乳腺癌细胞系包括MCF-7和T47D(Luminal型)、SKBR3(HER2过表达型)以及MDA-MB-231和BT549(三阴型)中的本底表达水平。在乳腺癌细胞中过表达或通过慢病毒法稳定敲减Atg7,随后通过CCK8、transwell、免疫印迹以及细胞流式分别检测细胞的增殖水平、迁移水平、上皮间质转换情况和细胞凋亡水平以验证Atg7在乳腺癌细胞中的功能。4.SEA-HORSE检测细胞线粒体内有氧氧化磷酸化和有氧糖酵解水平以验证Atg7对细胞能量代谢的影响。5.裸鼠成瘤实验采用皮下注射法注射BT-549细胞检测Atg7在体内对三阴型乳腺癌细胞生长速度的影响。结果:1.Atg7 mRNA高表达的乳腺癌患者预后较好,是保护因素(P<0.01)。90例各个分子分型的乳腺癌患者免疫组化结果显示,Atg7蛋白在三阴型乳腺癌中的表达明显低于癌旁导管组织,且差异较其他分子分型更有统计学意义(P<0.001)。对三阴型乳腺癌组织芯片进行免疫组化和统计学分析发现,Atg7蛋白与三阴型乳腺癌患者的年龄、Ki-67水平、组织学分级、TNM分期以及淋巴结转移具有相关性(P均<0.05),而与肿瘤大小无关。对42例乳腺癌患者的免疫组化结果所绘制KM生存曲线结果表明,Atg7高表达患者总体生存时间较长(P=0.005)。此外,多因素Cox回归分析也提示Atg7高表达为患者总体生存期延长的保护因素[HR(95%CI)=0.279(0.107-0.727),P=0.009]。2.Western Blot结果显示,Atg7在三阴型乳腺癌细胞系中的本底表达明显低于非三阴型乳腺癌细胞系。在三阴型乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT549中过表达Atg7后,细胞的增殖水平和迁移水平明显降低、上皮间质转换被明显抑制并且流式检测显示细胞凋亡水平增加。3.在非三阴型乳腺癌细胞MCF-7中敲减Atg7后并进行回补实验,结果发现,MCF-7中敲减Atg7后细胞增殖水平和迁移水平明显升高,而上皮间质转换受到抑制。再回补Atg7后细胞增殖水平和迁移水平又降低,上皮间质转换被促进。4.在过表达Atg7后,SEA-HORSE检测到MDA-MB-231和BT549细胞线粒体内的有氧氧化磷酸化水平和有氧糖酵解水平均明显下降。并且MDA-MB-231和BT549细胞在过表达Atg7的基础上再给予有氧糖酵解促进剂Oligomycin后,被Atg7上调所抑制的上皮间质转换指标被挽救。5.经过35天成瘤实验后,Atg7过表达组的瘤体积明显小于NC组(P<0.005)。结论:1.与非三阴型乳腺癌和癌旁相比,Atg7在三阴型乳腺癌组织中表达较低;2.Atg7高表达的三阴型乳腺癌患者预后较好,Atg7可作为三阴型乳腺癌的预后指标;3.Atg7可抑制三阴型乳腺癌细胞的迁移、增殖和抑制上皮间质转换,并促进细胞凋亡。4.Atg7可降低三阴型乳腺癌细胞线粒体内有氧代谢水平,并且通过有氧糖酵解途径调控上皮间质转换。