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目的:观察脂联素(Adiponectin,APN)预处理能否有效改善9月龄APP/PS1/tau三转基因阿尔茨海默病(triple transgenic Alzheimer’s disease model,3xTg-AD)模型小鼠的焦虑和抑郁样行为,并探讨其可能机制。方法:本实验采用雄性9月龄3xTg-AD小鼠和其背景鼠C57BL/6J小鼠(wild type,WT),随机分为四组,即:野生型对照组(WT+Saline)、野生型给药组(WT+APN)、3xTg-AD小鼠对照组(3xTg-AD+Saline)、3xTg-AD小鼠给药组(3xTg-AD+APN),每组8-10只。连续10天经侧脑室注射0.1μg/4μl的脂联素或等体积的生理盐水,给药时动物清醒并可自由活动,10天后进行行为学实验,在行为学实验期间给药仍然持续。行为学实验分为3部分按顺序进行:(1)糖水偏好实验:在安静环境下,第一天给予小鼠两瓶糖水使其自由饮用,第二天给予小鼠一瓶糖水、一瓶清水,第三天使小鼠禁水禁食24 h,之后开始测试。测试时给予小鼠等量的清水与糖水各一瓶,记录其2 h内的清水及糖水饮用量,结束测试后计算糖水偏好率(糖水饮用量/(糖水饮用量+清水饮用量))。(2)高架十字迷宫实验:在糖水偏好实验完成后的第二天进行实验。实验时将小鼠面朝开放臂放入中央区域使其自由活动5min,记录5 min内小鼠的总进臂次数及其在开放臂停留时间,计算小鼠在开放臂中的停留时间百分比(开放臂停留时间/5min×100%)。(3)悬尾实验:在高架十字迷宫实验完成后的第二天进行。将小鼠的尾部悬挂在悬尾箱中,记录6 min内小鼠的不动时间,计算不动时间百分比(小鼠的不动时间/6min)。行为学实验结束后,部分小鼠取脑进行免疫组化实验。小鼠用5%水合氯醛腹腔注射麻醉,心脏灌注PBS和4%多聚甲醛,之后将脑组织置于4%多聚甲醛及30%蔗糖中固定、脱水,采用冰冻切片,脑片厚度25μm。将脑片置于5%的山羊血清中封闭,而后加入一抗过夜,之后加入二抗孵育、SABC孵育和DAB染色液显色,封片后在光学显微镜下观察海马中星形胶质细胞和小胶质细胞的染色情况。行为学实验结束后,部分小鼠取脑进行Western blot实验。小鼠用5%水合氯醛经腹腔注射麻醉后,快速断头、取脑、分离出海马组织并提取蛋白、而后进行SDS-PAGE电泳,电泳完成后将蛋白转移至PVDF膜上。用5%胎牛血清(BSA)封闭2 h,加入相应一抗4℃孵育过夜、二抗4℃孵育2 h,完成后滴加ECL发光液于膜上进行曝光,并运用Alpha View SA软件分析目的蛋白(p-AMPK、t-AMPK、SIRT1、p-GSK-3β(ser9)、t-GSK-3β)的相对灰度值。结果:(1)脂联素可以明显改善9月龄3xTg-AD小鼠的焦虑样行为。在高架十字迷宫中,3xTg-AD+Saline组小鼠在开放臂的停留时间百分比明显低于WT+Saline组小鼠(P<0.01),表明9月龄3xTg-AD小鼠出现焦虑样行为。给予脂联素预处理后,3xTg-AD小鼠在开放臂的停留时间百分比显著增加(P<0.01),表明脂联素可以有效缓解3xTg-AD小鼠的焦虑样行为。同时,四组小鼠的总进臂次数无统计学差异,表明基因突变和脂联素均未影响小鼠的运动能力。(2)脂联素可以明显改善9月龄3xTg-AD小鼠的抑郁样行为。在糖水偏好实验中,3xTg-AD+Saline组小鼠的糖水偏好率明显低于WT+Saline组小鼠(P<0.01);给予脂联素后,3xTg-AD小鼠的糖水偏好率明显增加(P<0.05)。同时,四组小鼠总饮水量无统计学差异,表明基因突变和脂联素均未影响小鼠的饮水情况。在悬尾实验中,3xTg-AD+Saline组小鼠的不动时间百分比明显高于WT+Saline组小鼠(P<0.001);给予脂联素后,3xTg-AD小鼠的不动时间百分比明显减少(P<0.05)。以上结果表明,9月龄3xTg-AD小鼠出现抑郁样行为,脂联素预处理可以有效缓解3xTg-AD小鼠的抑郁样行为。(3)脂联素能够抑制3xTg-AD小鼠海马组织中星形胶质细胞和小胶质细胞的过度活化。在免疫组化实验中,各组小鼠海马区均有小胶质细胞(Iba-1)和星形胶质细胞(GFAP)的激活。与WT+Saline组小鼠相比,3xTg-AD+Saline组小鼠海马区的Iba-1和GFAP免疫阳性面积增大(P<0.001),表明小胶质细胞和星形胶质细胞的激活数量增多。给予脂联素预处理后,能有效减少3xTg-AD小鼠海马组织中Iba-1和GFAP的免疫阳性面积(P<0.001),表明脂联素能有效抑制3xTg-AD小鼠海马组织中星形胶质细胞和小胶质细胞的过度活化。(4)脂联素上调3xTg-AD小鼠海马组织中p-AMPK和p-GSK-3β(ser9)的表达水平,但未影响SIRT1的表达水平。各组小鼠海马组织中的t-AMPK和t-GSK-3β的相对蛋白表达水平无统计学差异。与WT+Saline组小鼠相比,3xTg-AD+Saline组小鼠海马组织中的p-AMPK和p-GSK-3β(ser9)的表达量均有所下降(P<0.05);而给予脂联素后,3xTg-AD小鼠海马组织中p-AMPK和p-GSK-3β(ser9)的表达量都明显增加(P<0.05)。同时,3xTg-AD+Saline组小鼠海马组织中SIRT1的表达量明显低于WT+Saline组小鼠(P<0.05),但脂联素预处理未能上调3xTg-AD小鼠海马组织SIRT1的表达水平。结论:(1)9月龄3xTg-AD小鼠出现了明显的焦虑和抑郁样行为,脂联素预处理能够有效改善3xTg-AD小鼠的焦虑和抑郁样行为。(2)9月龄3xTg-AD小鼠表现出海马组织中星形胶质细胞和小胶质细胞过度活化,以及p-AMPK、p-GSK-3β(ser9)和SIRT1表达水平下调;脂联素预处理能够抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的过度活化,上调p-AMPK和p-GSK-3β(ser9)表达水平。(3)脂联素可能是通过上调p-AMPK和p-GSK-3β(ser9)分子表达水平、抑制脑内神经炎性反应来改善3xTg-AD小鼠的焦虑和抑郁样行为的。