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随着后基因组时代的到来,影响生物性状发育的关键基因或信号被越来越多的挖掘。通过性状关键靶点精准培育目标品种已成为当前畜禽分子育种的最新理念。然而在育种工作实际开展前对筛选靶点进行系统全面的功能研究和机制解析是关键,而在此过程中对目标靶点进行敲除或敲入则是第一步。目前在哺乳动物中基于CRISPR/Cas9的基因定点编辑技术已经日益成熟并获得转基因动物,促进了哺乳动物功能基因组学的后续发展;在家禽上,虽然已有研究成功将基因编辑后的鸡原始生殖细胞注入正常健康的鸡中形成转基因嵌合体鸡,但是由于其繁殖生理的特殊性,目前在基因编辑效率、转基因动物生产方法上的研究不尽人意,阻碍了禽类功能组学的研究进程,导致基于性状靶点进行分子育种的想法不易实施。因此,需要深入探究CRISPR/Cas9定向编辑技术的作用机制,优化基因定向敲除/敲入的体系与条件,以获得高效精准靶向定点的基因敲除/敲入系统。与传统转基因技术的随机敲入不同,CRISPR/Cas9定向编辑技术能够准确地将外源基因插入到指定位点,但是敲入的序列会影响位点附近功能基因的表达,因此敲入位点的选择十分重要,需要在不影响机体正常生长发育前提下保证外源基因表达。研究发现鸡NC006127.4和非重复序列EE0.6位点可作为潜在的安全位点,即在此位点进行基因定点编辑不仅可以避免因外源基因的插入导致内源基因的沉默从而影响个体的发育,也符合动物福利和伦理道德。为此,本研究对EE0.6和NC006127.4位点进行靶向敲除,系统地探明这两个位点的编辑对鸡DF-1细胞正常生长增殖的影响,并在此基础上构建靶向EE0.6和NC006127.4的CRISPR/Cas9定点编辑系统,并从转染试剂、sgRNA组合、Cas9酶类型以及donor供体同源臂长短和类型等方面优化定点编辑系统,以建立精准的靶向定点的基因敲入系统,为后续在鸡基因组两安全位点处敲入功能性基因,创制转基因鸡模型用于探究基因功能组学提供技术支撑。初步研究结果如下:（1）EE0.6和NC006127.4位点安全性检测通过CRISPOR在线网站对EE0.6位点序列设计三条特异性的sgRNA并连入VK001-08 载体中构建 CRISPR/Cas9 敲除载体,分别命名为 EE0.6-sgRNA1/Cas9、EE0.6-sgRNA2/Cas9、EE0.6-sgRNA3/Cas9。将构建的敲除载体分别转染DF-1细胞,48h后观察到细胞中存在EGFP绿色荧光表达,通过qRT-PCR和Western Blot检测了 Cas9的表达情况,结果显示转染载体的DF-1细胞中均有Cas9的表达,说明构建的载体具有表达活性。T7E1酶切结果显示构建的三个sgRNA/Cas9载体均有切割活性,TA克隆测序结果显示三个CRISPR/Cas9载体靶向EE0.6基因敲除效率分别为80.00%（16/20）、75.00%（15/20）和75.00%（15/20）,进一步的SSA体外活性检测结果显示,1#和2#sgRNA载体敲除活性优于3#sgRNA载体。利用相同方法对NC006127.4位点序列设计三条特异性sgRNA,并将其连入VK001-08 载体中构建 CRISPR/Cas9 敲除载体,分别命名为 NC006127.4-sgRN A1/Cas9、NC006127.4-sgRNA2/Cas9、NC006127.4-sgRNA3/Cas9。将构建的敲除载体分别转染转染DF-1细胞,48h后观察到细胞中存在EGFP绿色荧光表达,qRT-PCR和Western Blot检测结果显示转染载体的细胞中存在Cas9的表达,表明构建的三个CRISPR/Cas9载体均具有表达活性。T7E1酶切结果也显示三条sgRNA均存在靶向切割活性,进一步进行TA克隆检测实际敲除效率,结果显示,三个CRISPR/Cas9载体的敲除效率分别为 70.00%（14/20）、60.00%（12/20）和 45.00%（9/20）,SSA 体外活性检测结果与TA克隆结果相一致,即1#和2#sgRNA载体敲除活性优于3#sgRNA载体。为了检测EE0.6和NC006127.4敲除后对细胞正常生长增殖的影响,本实验通过EdU和CCK-8检测敲除两位点后DF-1增殖能力的变化,结果显示,EE0.6和NC006127.4敲除前后DF-1细胞的增殖能力变化并不显著,两位点为安全位点。（2）靶向鸡定点敲除系统的建立和优化为了获得高效的基因敲除效率,本研究首先对转染试剂进行筛选。分别利用ViaFect、FugeneHD、Lipofectamine 2000 和 Lipofectamine 8000 转染细胞,结果显示ViaFect 的转染效率为（77.33±2.87）%,极显著高于其他三种转染试剂（P＜0.01）,且通过对转染细胞死亡率的检测发现相较于其他三组,ViaFect转染组细胞死亡率最低,仅为（7.33±1.25）%,这些结果说明ViaFect转染试剂具备高效低毒的特性,可用于后续转染实验。为探究sgRNA组合表达对敲除效率的影响,将构建的sgRNA/Cas9载体分别以sg1+2、sg1+3和sg2+3两两组合的形式共转染进DF-1细胞中,结果显示:共转染两个sgRNA的敲除效率高于单转sgRNA载体的效率,其中EE0.6位点的sg1+2组的实际敲除效率最高,为86.70%（13/15）;NC006127.4位点的sg1+2组的实际敲除效率最高为75.00%（9/12）。随后,为了探究在双sgRNA共转录对敲除效率的影响,本研究构建了双sgRNA-Cas9系统并转染DF-1细胞,结果显示:与共转染组合sgRNA/Cas9载体相比,双sgRNA/Cas9载体的敲除效率更高,EE0.6-2sgRNA/Cas9的实际敲除效率为86.67%（13/15）,而 NC006127.4-2sgRNA/Cas9 的敲除效率为 75.00%（9/12）。以上结果表明双靶点的sgRNA/Cas9系统具有更好的敲除效率。此外,本研究在此基础上对Cas9蛋白切口类型进行进一步改造,即利用突变的Cas9n（CasD10A）切口酶代替原有的Cas9酶发挥切割作用。结果表明sgRNA/Cas9n载体具有更高的敲除活性,TA克隆结果显示,较sgRNA/Cas9载体而言,sgRNA/Cas9n载体靶向EE0.6位点的敲除效率提高到93.33%（28/30）,NC006127.4位点的敲除效率最高为80.77%（21/26）。随后,结合Cas9n切口酶与双sgRNA系统,对原sgRNA/Cas9系统进行双优化,构建了双sgRNA/Cas9n系统。结果显示,EE0.6-2sgRNA/Cas9n的实际敲除效率为100%（28/28）,而NC006127.4-2sgRNA/Cas9n的敲除效率达到80.00%（16/20）。综上结果表明,双sgRNA-Cas9n系统靶向敲除效果最优。（3）靶向鸡定点敲入系统建立和优化为了探究同源臂序列长度对敲入效率的影响,根据NCBI数据库中EE0.6的序列以及前期筛选出的敲除活性最强的sgRNA1序列,扩增出sgRNA1靶位点上下游200bp、600bp和1000bp的片段,并与外源含SV40启动子的mCherry序列进行三段式连接,形成“HA-L+mCherry+HA-R”片段,将其连入PUC57载体中,构建不同长度同源臂序列的靶向EE0.6位点的供体donor载体,测序结果显示,不同长度同源臂的外源mCherry敲入载体构建成功,将其命名为EE0.6-200HA-donor、EE0.6-600HA-donor和EE0.6-1000HA-donor。将构建的供体donor载体与sgRNA1/Cas9载体共转染进DF-1细胞中,48小时后观察到有mCherry和EGFP荧光同时表达,qRT-PCR和Western Blot检测到转染细胞中均有mCherry和Cas9的表达,验证了三个EE0.6-donor载体具有表达活性。进一步对不同长度同源臂供体模板进行敲入效率检测,通过设计基因组上EE0.6靶位点上下200bp、600bp和1000bp的扩增引物,并对共转染sgRNA1/Cas9和donor载体的DF-1细胞基因组进行扩增,若基因组EE0.6靶位点序列处存在外源片段的插入,则扩增片段长度为原基因组上扩增的序列长度加上外源片段长度。PCR结果显示,当上下游同源臂为200bp、600bp和1000bp时,在EE0.6位点处均存在基因敲入现象,灰度分析量化外源mCherry序列整合进基因组表达情况,结果显示供体模板EE0.6-200HA-donor、EE0.6-600HA-donor 和 EE0.6-1000HA-donor 的敲入效率分别为（50.4±4.4）%、（48.0±0.3）%和（35.2±2.4）%。利用相同方法,在NCBI数据库中获取NC 006127.4序列,并根据前期筛选出的敲除活性最强的1#sgRNA载体,设计扩增sgRNA1靶位点上下游200bp、600bp和1000bp的片段,与外源含SV40启动子的mCherry序列进行三段式连接,并将其连入PUC57载体中,构建不同长度同源臂序列的靶向NC006127.4位点的供体donor载体,测序结果显示,不同长度同源臂的外源mCherry敲入载体构建成功,将其命名为NC006127.4-200HA-donor、NC006127.4-600HA-donor和NC006127.4-1000HA-donor。将构建的供体donor载体与sgRNA1/Cas9载体共转染进DF-1细胞中,48小时后观察到有mCherry和EGFP荧光同时表达,且qRT-PCR和Western Blot检测结果显示,转染细胞中均有mCherry和Cas9的表达,证实了构建三个NC006127.4-donor载体具有表达活性。进一步对不同长度同源臂供体模板进行敲入效率检测,通过设计基因组上NC006127.4靶位点上下200bp、600bp和1000bp的扩增引物,并对共转染sgRNA1/Cas9和donor载体的DF-1细胞基因组进行扩增,验证基因组中有无外源mCherry序列的整合。结果显示,当同源臂长度为1000bp时,仅有部分发生基因敲入的现象,同源臂为200bp和600bp时,外源mCherry均能插入到基因组靶位点上,灰度分析结果显示其敲入效率分别为（24.4±0.2）%和（30.1±1.2）%,对敲入片段进行切胶纯化回收,测序结果证实插入序列为外源mCherry报告基因。综上结果表明,靶向EE0.6和NC006127.4序列的短同源臂的供体donor载体更易发生外源mCherry序列的敲入。同时,本研究进一步将供体模板线性化,探究供体模板类型对敲入效率的影响。通过对前期筛选的敲入活性较高的上下游200bp和600bp的供体模板进行单酶切,将环状的donor载体线性化后,与sgRNA/Cas9载体共转染进DF-1细胞,48h后观察到mCherry和EGFP的荧光表达,且qRT-PCR和Western Blot检测结果证实了转染细胞中均存在mCherry和Cas9,表明线性化的donor载体也具备表达活性。进一步对转染细胞样基因组进行上下游200bp和600bp的目的片段扩增,并对PCR跑胶结果进行灰度分析,结果显示,当同源臂长度为200bp和600bp时,靶向EE0.6位点的敲入效率分别为（62.7±0.8）%和（78.9±1.0）%;NC006127.4 位点的敲入效率分别为（49.9±0.4）%和（42.0±1.0）%,对有敲入的片段进行切胶纯化回收并测序,blast序列比对结果验证了敲入mCherry片段的真实性。综上结果表明,上下游600bp同源臂的线性供体模板更适于敲入EE0.6位点;而上下游200bp同源臂的线性供体模板更适于将外源mCherry序列整合进NC006127.4基因座中。