论文部分内容阅读
背景:SFTS(Severe fever with thrombocytopenia syndrome)是由 SFTSV(SFTSvirus,SFTS病毒)引起的以发热和血小板减少为典型临床特征的自然疫源性人兽共患传染病。2009年该病在中国首次被发现,该病病原体是一种可感染人类并致死的新型布尼亚病毒,该病毒除感染人之外,还可以感染牛、羊、猪、狗、猫等家畜和鼠、鼩鼱等啮齿类动物。现在尚没有公认的特异性治疗方法,更无批准的人和动物的SFTSV疫苗。狂犬病病毒(rabies virus,RABV)感染引起的狂犬病(Rabies)是全球流行、危害严重的人兽共患传染病,病死率高达100%。我国是全球第二大狂犬病高发区,仅次于印度。全球每年因RABV感染的病犬传播造成的狂犬病死亡人数约5.9万,造成86亿美元的经济损失,严重危害人类健康。消除人类狂犬病最为经济有效的措施就是主动免疫,通过动物大规模接种狂犬病疫苗消除犬狂犬病,进而显著降低人类狂犬病发病率。鉴于SFTSV和RABV都是家养动物的常见人兽共患病原体,因此,研制一种安全、高效、经济的二联疫苗保护动物健康,具有非常重要的公共卫生学意义。目的:1.将SFTSV的保护性抗原Gn和Gc基因分别插入至RABV SAD(Street Alabama Dufferln)株基因组的假基因区,构建表达SFTSV Gn和Gc蛋白的重组狂犬病病毒SAD-Gn和SAD-Gc。2.检测SAD-Gn和SAD-Gc重组病毒的生物学特性、免疫原性、安全性和保护性,评价SAD-Gn和SAD-Gc作为二联重组活载体疫苗的潜力。方法:1.构建表达SFTSV Gn/Gc蛋白的重组狂犬病病毒SAD-Gn和SAD-Gc,通过RT-PCR、荧光抗体染色和Western blot实验鉴定重组病毒的生物学特性。2.安全性评价,免疫小鼠后,在21d观察期内,检测小鼠饮食、外形和体重,评价重组病毒SAD-Gn和SAD-Gc的安全性。3.免疫原性评价,分离第2、4、6、8周的血清,利用荧光抗体病毒中和试验(FAVN)和终点法中和试验分别检测RABV中和抗体效价和SFTSV中和抗体效价,检测重组病毒SAD-Gn和SAD-Gc的免疫原性。4.RABV攻毒保护实验,重组病毒SAD-Gn和SAD-Gc免疫小鼠21d后,肌肉注射RABV固定毒CVS-24,在观察期21d内,记录小鼠发病状况和死亡情况,评价重组病毒SAD-Gn和SAD-Gc对RABV的保护作用。5.SFTSV攻毒保护实验,重组病毒SAD-Gn和SAD-Gc免疫小鼠4周后,肌肉注射攻毒SFTSV,7d后分离小鼠脾脏,分析病理损伤并利用荧光探针法qRT-PCR检测SFTSV病毒载量,评价重组病毒SAD-Gn和SAD-Gc对SFTSV攻毒的保护作用。结果:1.通过RT-PCR、荧光抗体染色和Western blot实验均检测到SFTSV Gn蛋白和RABV G蛋白的表达,RT-PCR实验检测到SFTSV Gc蛋白表达,且分子量与预期大小相符。2.中和抗体水平检测结果显示,SAD-Gn和SAD-Gc重组病毒能诱导小鼠产生强烈的体液免疫,SAD-Gn组4周时中和抗体效价达到峰值,RABV中和抗体效价为4.13 IU/ml,SFTSV中和抗体效价为1:277;SAD-Gc组6周时中和效价达到峰值,RABV中和抗体为4.97 IU/ml,SFTSV中和抗体效价为1:256。3.在21 d观察期内,与空白组和SAD对照组相比,SAD-Gn和SAD-Gc重组病毒对小鼠饮食和体重影响较小,未出现任何狂犬病病症。4.RABV攻毒保护实验结果显示,攻毒后观察期结束时,空白组小鼠均出现典型的狂犬病病症,存活率为0,RT-PCR结果显示,死亡小鼠死于RABV的感染。SAD组、SAD-Gn组和SAD-Gc组小鼠未出现任何异常病症,小鼠存活率为100%。5.qRT-PCR检测SFTSV病毒载量结果显示,与空白组和SAD组相比,SAD-Gn和SAD-Gc重组病毒组SFTSV核酸定量明显减少。SAD-Gn组SFTSV核酸定量最少。结论:1.成功构建表达SFTSV Gn和Gc蛋白的重组狂犬病病毒SAD-Gn和SAD-Gc。2.SAD-Gn和SAD-Gc重组病毒在小鼠体内可诱导小鼠产生强烈的免疫应答,保护小鼠抵抗RABV致死性攻击,对SFTSV攻毒起到一定保护作用。为进一步研制预防狂犬病和SFTS的二联疫苗奠定了基础。