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研究目的研究Ⅱ型 cGMP 依赖性蛋白激酶(Type Ⅱ cGMP dependent protein kinase,PKG Ⅱ)对人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2,Her2)活化的影响和机制。研究PKGⅡ在L-精氨酸(L-Arginine,L-Arg)的激活作用下对胃癌细胞增殖以及胃癌移植瘤生长的影响和机制,从而为PKG Ⅱ的活化提供一种安全有效、经济实用的激活剂。研究方法采用编码PKG Ⅱ cDNA的腺病毒(Ad-PKGⅡ)感染细胞,使其高表达PKG Ⅱ,并以8-pCPT-cGMP或者L-Arg激活PKGⅡ,进行以下检测:采用Western Blotting检测相关蛋白的表达和磷酸化水平;采用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,CO-IP)方法检测PKG Ⅱ与Herb2的相互结合;采用免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)和Western Blotting方法检测PKG Ⅱ对Herb2丝氨酸和苏氨酸的磷酸化作用;采用基因定点突变法将Her2的686位苏氨酸(Thr 686)突变成天冬氨酸或丙氨酸,进而研究PKGⅡ对Her2的特异性磷酸化作用位点;采用ELISA试剂盒检测细胞中cGMP的含量;采用CCK8方法检测细胞的增殖活性;建立裸鼠皮下移植瘤模型,给予不同的处理,并对皮下瘤称量分析、对肿瘤组织相关蛋白进行检测。研究结果Co-IP结果显示PKG Ⅱ与Her2相互结合;IP与Western Blotting联合检测结果表明PKGⅡ使Her2发生丝/苏氨酸磷酸化;基因定点突变法实验结果明确了 Her2的Thr686是PKGⅡ特异的磷酸化位点;Western Blotting检测结果显示PKGⅡ通过使Her2 Thr686磷酸化而阻断EGF诱导的Her2第1248位酪氨酸(Tyr1248)磷酸化(活化)。ELISA检测结果显示L-Arg可以促进胃癌细胞产生cGMP;Western Blotting检测结果显示L-Arg可使PKGⅡ激活,进而抑制由表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)作用引起的EGF受体(EGF receptor,EGFR)第1068位酪氨酸(Tyr1068)的磷酸化(活化)及其下游关键信号转导分子细胞外调节蛋白激酶 1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)第 202 位苏氨酸(Thr202)/第 204位酪氨酸(Tyr204)磷酸化;CCK8方法和裸鼠皮下胃癌细胞移植瘤模型实验结果分别显示,L-Arg可以激活PKGⅡ,进而抑制胃癌细胞的增殖和胃癌细胞皮下移植瘤的生长。结论活化的PKGⅡ可通过使Her2的Thr 686位点发生磷酸化,从而抑制其活性。这一发现为深入了解PKGⅡ抑癌作用的机制提供了新的实验依据。L-Arg可以激活PKGⅡ,阻断EGFR的激活和相关的信号转导,进而抑制胃癌细胞的增殖和胃癌细胞皮下移植瘤的生长,表明L-Arg可以替代外源性cGMP作为PKG Ⅱ经济有效的激活剂。