【摘 要】
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多杀菌素是一种从刺糖多孢菌的发酵液中分离出来的生物农药,其活性成分为多杀菌素A和多杀菌素D。与传统化学农药相比,具有降解速度快、选择性强和环境安全等优势,广泛应用于防治田间双翅目、等翅目、膜翅目、鳞翅目等害虫。多杀菌素的生产主要来自于刺糖多孢菌的次级代谢,但是国内多杀菌素产能较低,不能满足市场需求。本课题主要通过菌种的诱变育种、基因组重排育种以及后续的发酵工艺优化提高多杀菌素的产量,为多杀菌素的工
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多杀菌素是一种从刺糖多孢菌的发酵液中分离出来的生物农药,其活性成分为多杀菌素A和多杀菌素D。与传统化学农药相比,具有降解速度快、选择性强和环境安全等优势,广泛应用于防治田间双翅目、等翅目、膜翅目、鳞翅目等害虫。多杀菌素的生产主要来自于刺糖多孢菌的次级代谢,但是国内多杀菌素产能较低,不能满足市场需求。本课题主要通过菌种的诱变育种、基因组重排育种以及后续的发酵工艺优化提高多杀菌素的产量,为多杀菌素的工业化奠定基础。首先,对出发菌株进行了紫外辐照诱变和亚硝基胍诱变,经过多轮诱变选育得到了产量提高且稳定的8U-19（110.77mg/L）和6N-1（95.76 mg/L）,较出发菌株（25.98 mg/L）分别提高了 3.26倍和2.69倍。在进行基因组重排育种前,通过响应面法（Response Surface Methodology,RSM）优化了原生质体制备、再生和融合的条件。确定了刺糖多孢菌原生质体制备的最佳条件为处理温度28℃,处理时间60.23 min,溶菌酶浓度11.8 mg/mL,制备数约为0.92×108,再生率约3.67%。在50%PEG2000条件下原生质体融合5min,融合率为0.58%;然后以上述菌株为亲本,进行二轮基因组重排育种获得到了一株产量为122.23 mg/L的菌株S.17-1。为了进一步提高产量和探索适合重组菌株的发酵工艺和条件,对获得的S.17-1进行了发酵工艺优化和发酵培养基优化,使其在合适的条件下最大程度发挥生产性能。优化后的发酵工艺为:斜面培养时间为8d,种龄48 h,接种量20%,发酵温度28℃,发酵培养基初始pH7.4,发酵时长为8d;紧接着对根据文献选择了合适的种子培养（g/L）:葡萄糖15、淀粉10、黄豆饼粉3、棉籽蛋白3、大豆蛋白胨25、MgSO4·7H2O2,pH7.2;优化后的发酵培养基为（g/L）:葡萄糖50;糊精20;鱼粉蛋白胨 30;NaCl20;Na2HPO4·3H2O2.84;FeSO4·7H2O0.06;CaCO35;精氨酸1.5;pH7.2;优化培养基之后多杀菌素的产量为728.72mg/L,相比较未优化前提高了 4.96倍。
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