大丽轮枝菌胞外蛋白VdAcb1的非经典分泌特性及致病功能研究

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大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)是一种土传性质的植物病原菌,其寄主范围较广泛,可侵染棉花、马铃薯、番茄、莴苣等多种重要的经济作物在内的数百种双子叶植物,造成寄主植物叶片黄化萎蔫、维管束褐化、生长缓慢的症状,是制约农业生产的重要植物病原菌。大丽轮枝菌含有数量庞大的致病基因,其分泌蛋白作为病原菌与寄主互作的重要功能元件,是近年来植物病理界研究的热点。与经典分泌蛋白质致病机理解析方面取得的巨大进展相比,关于非经典分泌蛋白质的研究较少。乙酰辅酶A结合蛋白(Acb A)是研究最深入的非经典分泌蛋白。在酵母和盘基网柄菌中已开展其研究,结果表明Acb A是一种非经典分泌蛋白,其分泌依赖于GRASP。另外,Acb A还与脂质代谢、产孢及菌丝生长有关。但在大丽轮枝菌中Acb A的功能未有报道,因此,本文围绕大丽轮枝菌Acb A(VdAcb1)的分泌特性与致病性功能开展研究。取得的主要研究结果如下:1.酵母信号肽追踪实验(the yeast signal trap assay)证明VdAcb1缺乏信号肽结构域。Western blot结果发现能够在大丽轮枝菌的培养液中检测到VdAcb1,激光共聚焦显微镜观察结果表明VdAcb1-GFP在侵染过程中能够转运到寄主表皮细胞外周,但缺乏Vd GRASP侵染导致荧光信号减弱。表明VdAcb1是一个非经典分泌蛋白,且它的分泌受到Vd GRASP调控而不受VdATG1调控。2.为进一步研究VdAcb1的功能,通过农杆菌介导的同源重组方法遗传转化构建了VdAcb1基因缺失突变体ΔAcb1及功能回补突变体,进行生长表型及产孢量测定,结果发现VdAcb1基因缺失不影响大丽轮枝菌基本的生长发育及其产孢能力。3.侵染棉花过程中VdAcb1基因显著上调表达,致病性实验表明,ΔAcb1对棉花和烟草的致病力均较野生型显著下降,VdAcb1基因的缺失影响了大丽轮枝菌在寄主中的定殖,说明VdAcb1在大丽轮枝菌致病过程中发挥着重要的作用,是致病性所必需的。纤维素膜穿透实验显示,VdAcb1基因缺失不影响大丽轮枝菌的穿透能力。分析了VdAcb1对碳源利用的影响,结果显示,ΔAcb1在果胶培养基上生长与野生型相比较缓慢。进一步分析发现,果胶处理可提高VdAcb1基因表达水平。另外,检测果胶降解及利用相关基因水平,发现在ΔAcb1中果胶降解及利用基因表达水平较野生型显著升高。以上结果表明,VdAcb1参与影响侵染过程大丽轮枝菌对于果胶的利用。综上所述,VdAcb1是一个非经典分泌蛋白,其分泌受Vd GRASP调控而不受VdATG1调控。VdAcb1通过影响大丽轮枝菌对于果胶的利用,提高病原菌对于侵染环境的适应性,最终影响大丽轮枝菌的致病性功能。
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