论文部分内容阅读
背景:肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌中最常见的病理类型,每年发病率及病死率均位居所有恶性肿瘤前列。尽管随着精准医疗及多学科联合诊治模式快速发展,HCC远期疗效仍不理想,5年总体生存率不到半数,肿瘤快速恶性进展及复发转移是HCC治疗失败主要因素。理解HCC恶性进展、侵袭转移及自我保护的分子机制并探索适宜的分子干预靶点,对改善HCC治疗效果具有十分重要意义。目的:本课题旨在研究组蛋白去甲基化酶PHF8在HCC中异常表达模式及临床病理意义,并深入探索PHF8对肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭转移及细胞自噬等生物学特性的调控作用及相应的分子机制。材料与方法:1、从10对有无门静脉癌栓(PVTT)的HCC组织转录测序结果中筛选差异表达基因;从TCGA、GEO及Oncomine等癌症公共数据库提取转录组数据,验证PHF8在肝癌及癌旁组织中表达模式;2、从浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科收集198对HCC组织及相应癌旁组织,利用RT-q PCR、免疫组织化学及Western-blot法验证PHF8在HCC组织及癌旁组织中表达差异性,并基于免疫组织化学结果,分析PHF8表达与HCC临床病理参数及预后之间的相关性;3、在PHF8异常高表达的SMMC-7721和Huh7肝癌细胞上,通过转染sh RNA慢病毒构建PHF8稳定敲除细胞模型;选用PHF8表达升高幅度较小的Hep G2和SK-Hep-1肝癌细胞,通过转染质粒构建PHF8过表达模型;联合CCK8、克隆形成和裸鼠皮下成瘤方法检测PHF8对肝癌细胞增殖影响;用流式细胞凋亡检测及Western-blot检测凋亡蛋白方法验证PHF8敲低对肝癌细胞凋亡抑制作用;运用Transwell迁移侵袭实验、划痕/伤口愈合实验以及裸鼠肝癌肺转移瘤模型研究PHF8对肝癌细胞侵袭转移促进作用;结合转染能表达m Cherry-GFP-LC3融合蛋白的腺病毒及Western-blot法检测自噬标志蛋白变化,探索PHF8对细胞自噬的调控作用;4、在PHF8敲低表达肝癌细胞模型上,利用RT-q PCR技术检测EMT相关基因的表达情况;同时在PHF8敲低表达及过表达细胞模型上,通过Western-blot技术对EMT相关分子的蛋白表达进行验证;基于PHF8过表达肝癌细胞模型,利用功能PHF8过表达-SNAIL1敲低回复实验,研究PHF8通过SNAIL1间接调控E-cadherin表达机制;5、利用GEPIA和ULACAN数据库,进行PHF8与细胞自噬相关基因的相关度分析;6、同时在PHF8敲低和过表达细胞模型上,运用RT-q PCR及Western-blot方法,验证与PHF8关联度最高的自噬相关基因FIP200表达变化情况;7、联合PHF8敲低-FIP200过表达功能回复实验,证明PHF8通过FIP200促肝癌细胞自噬及侵袭迁移作用;在此功能回复实验基础上,联合应用抑制蛋白合成药物CHX、蛋白酶抑制剂MG132及自噬抑制剂CQ,进行E-cadherin蛋白降解实验,探索PHF8通过FIP200-细胞自噬途径促E-cadherin蛋白降解机制;8、通过免疫组织化学技术在HCC组织上检测分析PHF8、FIP200及E-cadherin三者蛋白表达的相关性;9、利用Western-blot检测PHF8敲低或过表达对组蛋白H3K4me3、H3K9me1/2、H3K27me2和H4K20me1含量变化的影响;采用染色质免疫共沉淀(Ch IP)方法,研究PHF8以及组蛋白H3K4me3、H3K9me1/2、H3K27me2和H4K20me1在FIP200、SNAIL1、VIM、E-cadherin及N-cadherin基因启动子富集情况;利用ENCODE数据库分析PHF8和H3K4me3在FIP200、SNAIL1、VIM、E-cadherin及N-cadherin基因启动子区域结合和重叠情况。结果:1、在是否合PVTT的HCC组织中差异表达基因中,PHF8在合并PVTT的HCC组织中升高最为显著;癌症数据库分析、以及RT-q PCR、免疫组织化学和Western-blot法对临床标本检测结果,均证实PHF8在HCC组织中表达量明显高于癌旁组织,PHF8高表达与HCC肿瘤大小、包膜不完整性、低级别分化、肿瘤分期以及不良预后明显正相关,是HCC不良预后独立因子;另外,PHF8在肝癌细胞株中表达水平明显高于正常肝细胞;2、体内外功能实验显示:PHF8敲低可明显抑制肝癌细胞增殖速度、克隆形成、肿瘤生长速度及大小、迁移侵袭力、划痕/伤口愈合速度、以及细胞自噬形成,增加肝癌细胞凋亡比例及凋亡蛋白表达,而这些现象在PHF8过表达后呈相反方向改变;3、PHF8敲低可改变EMT相关分子的表达量,下调SNAIL1、VIM和N-Cadherin表达,上调E-cadherin表达;这些分子表达量在PHF8过表达后朝相反方向改变;其中E-cadherin蛋白比其m RNA更容易被PHF8所调控;4、在PHF8过表达-SNAIL1敲低回复实验中,RT-q PCR结果显示PHF8对E-cadherin的m RNA表达抑制效应可被SNAIL1敲低完全解除,Western-blot结果则显示PHF8对E-cadherin蛋白表达抑制作用部分被SNAIL1敲低所抵消;5、生物信息分析显示:在自噬相关基因中,PHF8水平和FIP200表达之间相关度最大,r=0.47,P<0.0001;RT-q PCR及Western-blot结果显示,FIP200表达在PHF8敲低后显著下降,而PHF8过表达后则明显升高;6、联合PHF8敲低-FIP200过表达功能回复实验显示:PHF8敲低对肝癌细胞自噬形成和侵袭迁移力的抑制作用,可被FIP200过表达明显逆转;7、E-cadherin蛋白降解实验结果表明:E-cadherin蛋白降解速度基本不受MG132蛋白酶抑制剂的影响,但可明显被自噬抑制剂CQ或PHF8敲低所延缓;PHF8敲低对E-cadherin蛋白降解速度的抑制效应可明显被FIP200过表达抵消;8、HCC临床组织标本的免疫组织化学染色结果发现:PHF8和FIP200两者的蛋白表达量正相关r=0.6016,P<0.0001;而两者表达量与E-cadherin蛋白水平均负相关,r分别为-0.3017和-0.3750,P值均小于0.0001;9、敲低PHF8可明显降低H3K4me3蛋白量,增加H3K9me1/2、H3K27me2和H4K20me1蛋白水平,而这些组蛋的蛋白量在PHF8过表达后朝相反方向改变;10、ENCODE数据库分析显示PHF8与H3K4me3均能富集在FIP200、SNAIL1及VIM启动子区域,且所结合的启动子区段高度重合;Ch IP结果显示:PHF8和H3K4me3均能结合到FIP200、SNAIL1及VIM启动子区,PHF8敲低可明显抑制结合过程;另外,FIP200启动子区域还能结合H3K9me1/2,而SNAIL1能同时结合H3K9me1/2和H3K27me2,但它们的结合富集作用在PHF8敲低后明显增强。结论:1、较之正常肝组织,PHF8在HCC组织中表达明显升高,并提示HCC恶性进展及不良预后;2、PHF8既能够促进肝癌细胞增殖、侵袭转移及细胞自噬,又可以抑制细胞凋亡;3、PHF8通过上调FIP200增强肝癌细胞自噬形成;而PHF8-FIP200-细胞自噬途径可促使E-cadherin蛋白降解和肝癌细胞侵袭转移;4、PHF8参与FIP200、SNAIL1及VIM基因表达的转录激活过程,PHF8介导的H3K4me3上调及H3K9me1/2和H3K27me2下调在其中可能起到重要作用。