论文部分内容阅读
丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是一类广泛存在于细胞内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。研究证实，MAPKs通路是重要的信号转导系统，可将细胞外的刺激信号转导至细胞及其胞核内，在引起一系列的细胞生物学反应如细胞增殖、转化、分化及凋亡等过程中发挥重要的作用。MAPKs家族主要包括4个亚族: ERK、JNK、p38MAPK和ERK5。p38MAPK在1993年被Brewster、Han等发现，是MAPKs家族中的重要一员。谷氨酸是中枢神经系统内主要的兴奋性神经递质，脑缺血时细胞外液中异常升高的谷氨酸可引起兴奋性毒性作用，损伤神经元。而脑内突触间隙缺乏谷氨酸的代谢酶，主要依赖兴奋性氨基酸转运体（excitatory aminoacid transporters, EAATs）来调节其浓度，目前认为EAAT2在维持细胞外液谷氨酸浓度方面发挥着主要作用，因其蛋白主要存在于星型胶质细胞，又被称为胶质细胞谷氨酸转运体1（glial glutamate transporter-1, GLT-1）。因此，调制GLT-1的功能，是防止由过多的谷氨酸导致的兴奋性毒性作用的有效方法。我室既往的研究结果表明，脑缺血预处理（cerebral ischemicpreconditioning，CIP）可上调p-p38MAPK及GLT-1蛋白的表达，p-p38MAPK蛋白表达的上调早于GLT-1蛋白表达的上调；且p38MAPK的特异性抑制剂SB203580可抑制CIP诱导的脑缺血耐受及GLT-1表达上调。反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，AS-ODNs）是一类人工合成的、可与靶基因DNA或mRNA结合而抑制目的基因和蛋白表达的单链核苷酸片段。本实验通过应用p38MAPK AS-ODNs，观察其对CIP诱导的脑缺血耐受及GLT-1蛋白表达的影响，进一步探讨p38MAPK信号通路在CIP上调GLT-1表达诱导的脑缺血耐受中的作用。1CIP诱导脑缺血耐受过程中p38MAPK的活化和GLT-1蛋白的表达上调方法：40只健康雄性Wistar大鼠（280～300g），永久凝闭椎动脉，恢复2天后，随机分为以下4组：①sham组（n=10）：只暴露双侧颈总动脉，但不阻断其血流；②CIP组（n=10）：夹闭双侧颈总动脉3min作为CIP，之后恢复血流灌注；③脑缺血损伤（ischemic insult，II）组（n=10）：夹闭双侧颈总动脉8min作为损伤性脑缺血，之后恢复脑血流灌注；④CIP+II组（n=10）：夹闭双侧颈总动脉3min，恢复血流再灌注2天后，再次夹闭双侧颈总动脉8min。以上各组动物均在sham手术或末次脑缺血/再灌注后6h和2d（每个时间点n=5）断头取脑，分离海马CA1区，应用Western blot分析p-p38MAPK及GLT-1蛋白的表达。结果：p-p38MAPK蛋白的表达在6h时间点sham组大鼠海马CA1区的p-p38MAPK蛋白有一定量的基础表达。与sham组相比，CIP组p-p38MAPK蛋白的表达明显升高（P＜0.05），为基础表达值的1.25倍；II组p-p38MAPK蛋白表达显著上升，为基础表达值1.64倍（P＜0.01），为CIP组的1.32倍（P＜0.05）。CIP+II组与II组相比，p-p38MAPK蛋白表达明显下降（P＜0.05），接近sham水平。2d时间点p-p38MAPK蛋白在各组表达的变化趋势均与6h时间点相类似。GLT-1蛋白的表达在6h时间点，Sham组大鼠海马CA1区的GLT-1蛋白有一定量的基础表达。与sham组相比，CIP组GLT-1蛋白表达升高（P＜0.05），为基础表达的1.18倍；II组GLT-1蛋白的表达显著下调，是基础值的0.28倍（P＜0.01），是CIP组的0.24倍（P＜0.05）。CIP+II组与II组相比，GLT-1蛋白表达明显上升（P＜0.05），接近sham水平。2d时间点GLT-1蛋白在各组表达的变化趋势均与6h时间点相类似。小结：①CIP引起p-p38MAPK的适度升高，并可抑制脑缺血打击引起的p-p38MAPK的过度升高。②CIP引起GLT-1蛋白表达显著升高，并可抑制脑缺血打击引起的GLT-1表达的下调。2p38MAPK AS-ODNs对CIP诱导的脑缺血耐受过程中p-p38MAPK和GLT-1蛋白表达的影响方法：110只健康雄性Wistar大鼠（280～300g），永久凝闭椎动脉，恢复2天后，随机分为以下7组：①s ham组（n=10）；②CIP组（n=10）；③C IP+II组（n=10）；④p38MAPK AS-ODNs+CIP组（n=30）；⑤p38MAPKAS-ODNs+CIP+II组（n=30）；⑥p38MAPKS-ODNs+CIP组（n=10）；⑦p38MAPK S-ODNs+CIP+II组（n=10）。其中④、⑤组中，根据p38MAPK AS-ODNs注射剂量不同，进一步分为5nmol、10nmol和15nmol共3个亚组；p38MAPK S-ODNs的注射剂量为15nmol。p38MAPKAS-ODNs及p38MAPK S-ODNs均溶于15μL人工脑脊液（artificialcerebrospinal fluid，ACSF）中，于凝闭锥动脉前1天开始注射，每天1次，连续注射5天，至CIP后1天结束。其中CIP6h时间点大鼠只能注射4次。以上各组动物均在sham手术或末次脑缺血/再灌注后6h和2d（每个时间点n=5）断头取脑，分离海马CA1区，应用Western blot检测p-p38MAPK及GLT-1蛋白的表达。结果：在6h时间点，p38MAPKAS-ODNs+CIP组中，随着p38MAPKAS-ODNs剂量的增大，p-p38MAPK和GLT-1蛋白的表达呈剂量依赖性降低。与CIP组相比，5nmol组、10nmol组、15nmol组中p-p38MAPK蛋白、GLT-1蛋白的表达均明显下调（P＜0.05）；10nmol组与5nmol组相比，p-p38MAPK蛋白、GLT-1蛋白表达均明显降低（P＜0.05）；15nmol组与10nmol组相比，p-p38MAPK蛋白、GLT-1蛋白的表达进一步下降（P＜0.05）。p38MAPK S-ODNs+CIP组与CIP组相比，p-p38MAPK和GLT-1蛋白表达均无明显差别（P＞0.05）。在6h时间点，p38MAPKAS-ODNs+CIP+II组中，随着p38MAPKAS-ODNs剂量的增加，p-p38MAPK和GLT-1蛋白的表达剂量依赖性地下降。5nmol组、10nmol组、15nmol组与CIP+II组相比，p-p38MAPK蛋白、GLT-1蛋白的表达均明显下降（P＜0.01）；10nmol组与5nmol组相比，p-p38MAPK蛋白、GLT-1蛋白的表达均明显降低（P＜0.05）；15nmol组与10nmol组相比，p-p38MAPK蛋白、GLT-1蛋白的表达进一步明显下降（P＜0.05）。p38MAPK S-ODNs+CIP+II组与CIP+II组相比，p-p38MAPK和GLT-1蛋白表达均无明显差别（P＞0.05）。在上述两个不同的处理因素中，2d时间点p-p38MAPK和GLT-1蛋白在各组表达的变化趋势均分别与6h时间点一致。小结：p38MAPK AS-ODNs剂量依赖性地阻断CIP、以及CIP诱导脑缺血耐受过程中p-p38MAPK和GLT-1蛋白表达的上调。3p38MAPK AS-ODNs对CIP诱导的脑缺血耐受的影响方法：45只健康雄性Wistar大鼠（280～300g），永久凝闭椎动脉，恢复2天后，随机分为以下7组：①sham组（n=5）；②C IP组（n=5）；③I I组（n=5）；④C IP+II组（n=5）；⑤A CSF+CIP+II组（n=5）；⑥p38MAPKAS-ODNs+CIP+II组（n=15）；⑦p38MAPK S-ODNs+CIP+II组（n=5）。在p38MAPKAS-ODNs+CIP+II组中，根据p38MAPKAS-ODNs注射剂量，进一步分为5nmol、10nmol和15nmol共3个亚组；p38MAPK S-ODNs的注射剂量为15nmol。所有动物均在sham手术后或末次全脑缺血/再灌注后7天断头取脑，硫堇染色观察海马CA1区锥体神经元迟发性死亡情况。结果：Sham组大鼠海马CA1区锥体神经元排列整齐、致密、共2~3层，细胞形态完整，胞核饱满，核仁清晰，均未见神经元受损，组织学分级（HG）为0级，ND值为196±6.93。CIP组大鼠海马CA1区锥体神经元无明显损伤，与Sham组相比，HG、ND均无明显差别。II组大鼠海马CA1区椎体神经元几乎全部缺失，出现了明显的迟发性神经元死亡，神经元密度明显下降，组织学分级为Ⅱ~Ⅲ级，ND值为17.33±6.11，与Sham组相比，HG明显升高（P＜0.01），ND值明显下降（P＜0.01）。CIP+II组大鼠海马CA1区椎体神经元排列整齐、致密，胞核饱满，核仁清晰，神经元的存活状态较II组有明显改善，即CIP可显著抑制脑缺血损伤引起的迟发性神经元死亡，与II组相比，HG明显下降（P＜0.05），ND值为178.67±6.11，显著上升（P＜0.05）。ACSF+CIP+II组大鼠海马CA1区椎体神经元排列整齐、致密，形态完整，未见明显的神经元受损，与CIP+II组相比，HG、ND均无明显差别（P＞0.05）。与ACSF+CIP+II组相比，p38MAPK AS-ODNs+CIP+II组出现了显著的迟发性神经元死亡，表现为组织学分级升高、锥体神经元密度降低，且此种变化与p38MAPK AS-ODNs的注射剂量呈明显正相关：5nmol组海马CA1区锥体神经元为散在神经元死亡，组织学分级Ⅰ级，ND值为123.56±11.33，与ACSF+CIP+II组相比，HG升高（P＜0.05），ND值下降（P＜0.05）；10nmol组海马CA1区锥体神经元死亡数量较多，成片死亡，组织学分级Ⅱ级，ND值为93.11±15.76，与5nmol组相比，HG均明显升高（P＜0.01），ND值均明显下降（P＜0.05）；15nmol组可见几乎全部锥体神经元死亡，组织学分级达到Ⅲ级，ND值为57.11±8.50，与10nmol组相比，HG进一步升高（P＜0.05），ND值进一步下降（P＜0.05）。p38MAPK S-ODNs+CIP+II组，未见明显的锥体神经元受损，与ACSF+CIP+II组相比，HG、ND均无明显差别（P＞0.05）。小结：p38MAPK AS-ODNs剂量依赖性地阻断CIP所诱导的脑缺血耐受。结论：p38MAPK信号通路参与CIP上调GLT-1表达诱导的脑缺血耐受。