精子发生和成熟过程关系到物种的延续,这一过程的异常往往导致生殖障碍和雄性不育。对不同雄性动物生殖生物学进行研究不仅有助于了解动物生殖规律,也与动物生产实践密切相关。脊椎动物精子发生模式在无羊膜动物到羊膜动物进化过程中发生变化。爬行动物精子发生在羊膜动物中具有过渡性和进化性意义。中华鳖是我国传统的水产养殖动物,常见的龟鳖目物种,具有较高的营养价值。认识和掌握中华鳖生殖生物学规律,不仅对于鳖的繁殖具有理论意义和潜在的应用价值,同时也能为爬行类动物生殖研究提供更为丰富的资料。斑马鱼作为重要的新型模式动物之一,是水生实验动物的代表性品种。虽然对斑马鱼精子发生过程已有一些报道,但资料并不详尽。本文分别对中华鳖和斑马鱼精子发生超微结构特征进行观测,进一步探究中华鳖精子结构变化与储存的关系及斑马鱼精子结构特点,并对繁殖期中华鳖和不同温度下斑马鱼精子发生过程中TLR2和TLR4的表达规律进行研究。在此基础上探讨结构与功能之间的联系。从细胞和分子水平阐明这两种水生动物雄性生殖生物学特性,为精子发生模式演化的研究提供理论依据,并为水生动物繁殖及资源利用等应用研究奠定基础。实验Ⅰ中华鳖精子的发生应用光镜和电镜技术,研究中华鳖精子发生过程中各阶段生殖细胞的超微结构和组织学特征。中华鳖精子发生过程依次经历A型精原细胞、B型精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子。精原细胞除了明显的核仁及异染色质外,胞质中包含大量的细胞器,主要是少嵴的线粒体、内质网、高尔基复合体和3-5个体积较小的Nuages。初级精母细胞体积增大,粗线期联会复合体清晰可见,胞质中具有发达的高尔基复合体、致密拉长的线粒体以及与囊泡和线粒体相连Nuages,甚至出现早期鞭毛。精子细胞变形过程中,经历了核浓缩拉长、顶体形成、鞭毛形成以及细胞质的排除。除此之外,中华鳖精子细胞发育过程中具有独特的结构变化:(1)精子细胞核浓缩过程中,微管机械性挤压胞核,多余的物质从顶体冒末端边缘形成空泡排出。(2)精子细胞头部形成管状复合物。(3)细胞质包含大而致密Nuages,精子形成后期依然存在。(4)精子形成过程中具有独特菊花状的内质网;第一期精子细胞开始出现,由内质网中心发出大量突起和分支,其突起与核膜、脂滴、线粒体、高尔基体和环孔板存在密切联系;精子形成后期内质网膨大成空泡。(5)精子形成过程伴随着脂滴的形成和发育,最终大量的脂滴保留于线粒体周围和头部后段,成为精子胞质小叶的主要成分。这些特征的发现为爬行动物的非传统的系统发育分析及相关功能研究提供重要参考。实验Ⅱ中华鳖精子结构变化及其与精子储存的关系研究许多动物能够储存精子于体内长达数年,来延长受精时间,但储存机制目前仍不清楚。本文应用光镜和电镜技术,研究中华鳖储存于附睾和输卵管中精子的变化,发现中华鳖精子呈现独特的形态变化过程。附睾中,精子具有体积较大的胞质小叶,包含数个脂滴,始终位于精子中段及头部后段,不向后移动;而输卵管中精子缺乏胞质小叶。提示胞质小叶储备的内源性能源物质,有利于附睾的精子储存。在输卵管储存后期,精子的洋葱样线粒体恢复至普通线粒体形态,为中华鳖线粒体代谢的变化的提供形态学基础。精子中段发达的致密纤维鞘为糖酵解酶和底物提供结合部位。这些独特的形态变化是中华鳖精子在不同的储存阶段利用不同的代谢方式和能量的来源的形态学依据。这些结构的变化有利于精子的长期储存。除此之外,中华鳖或许是揭示精子成熟和储存机制的潜在模型。实验Ⅲ中华鳖输卵管精子存储及精子与上皮的互作动物交配后将精子存储在雌性生殖道中,从而使得交配、受精和产卵等这些生殖过程在适当的时间发生。精子长期存储的机制仍不清楚。本研究使用光镜和电镜观察分析中华鳖精子和输卵管之间的相互作用,探究精子长期存储可能的细胞学机制。中华鳖全年都可存储精子于输卵管的峡部、子宫部和阴道部,这表明精子可以在体内长期存活。精子的头部常常嵌入到输卵管上皮纤毛之间,有些甚至插入到输卵管黏膜上皮细胞凹陷所形成的腔腺中。上皮细胞凹陷周围并没有溶酶体的分布,这说明输卵管中这些纤毛细胞不是吞噬精子而是能够维持精子储存。储存的精子也能在腺体导管中发现。尽管在输卵管黏膜的血管中存在少量免疫细胞,但输卵管上皮和固有层中很难发现有免疫细胞的分布。中华鳖输卵管的这些特征有利于作为外来细胞的精子在输卵管中长时间存活。这些发现将有助于了解中华鳖的生殖规律和物种保护策略的研究。实验Ⅳ中华鳖睾丸TLR2和TLR4的表达应用免疫组织化学(IHC)的方法探究中华鳖繁殖期不同月份睾丸TLR2和TLR4的分布特点,蛋白质印迹法(Western blot)研究TLR2和TLR4蛋白的表达差异。结果显示,TLR2表达于中华鳖睾丸生精上皮基底部的精原细胞,4月份、7月份和11月份差异不大。而TLR4在4月份精原细胞呈弱阳性反应;7月份可见生精上皮精原细胞、精母细胞和精子细胞TLR4呈阳性,精原细胞阳性较强;11月份排精季节,生精上皮依然成较强阳性,管腔中也存在阳性生精细胞,而精子阳性反应较弱。Western blot结果表明,4月、7月和11月中华鳖睾丸TLR2的表达并未表现出明显差异;而随着时间的推移,TLR4蛋白表达出现增高趋势,11月份显著增高。这一结果提示生殖细胞TLR4可能与中华鳖生精上皮的精子发生和排放有关。实验Ⅴ斑马鱼精子的发生斑马鱼是重要的模式动物,在生殖与发育生物学研究领域广泛应用,但关于斑马鱼生精细胞的细微结构特征的研究报道有限。本文应用光镜和透射电镜详细观察了斑马鱼精子发生过程中生殖细胞显微和超微结构的变化,发现了斑马鱼精子发生特殊的结构和变化规律。(1)斑马鱼精子形成的基本事件不同步,鞭毛定位在精子形成初期完成;核浓缩在中期发生;多余细胞质排放主要发生于后期。(2)精母细胞中发现早期鞭毛,早期精子细胞中近端中心粒携带鞭毛接近细胞核,陷入核凹窝,近端中心粒和基体由相互垂直转变成呈125°角。(3)精子形成过程中染色体的浓缩方式独特,精子细胞染色质不均匀地浓缩,从细颗粒状到染色质块;染色质块中央形成圆形或长条的低电子密度区,该区域不断缩小,最后形成精子细胞中的核泡。这也是斑马鱼精子核泡形成的首次发现。(4)Nuages存在于精原细胞和精母细胞中。它们与线粒体和细胞核直接接触,甚至在核周间隙中发现。(5)各时期生精细胞线粒体的形态与分布多样,粗线期精母细胞出现致密的线粒体,精母细胞和精子细胞同时存在包含膜团的线粒体。这些特征的发现将为斑马鱼精子发生相关分子学和功能的研究提供了形态学依据。实验Ⅵ斑马鱼精子的细微结构应用相差显微镜和电镜观察了斑马鱼精子的结构、几何学特征并对形态参数进行测量。抽取30只斑马鱼精液样品,用于相差显微镜和透射显微镜观察。斑马鱼精子总长度32.79±1.97μm,由无顶体球形头部、短椎形中片和尾部组成。头部偏向一侧,几乎被细胞核占据。精子细胞核均匀致密,但含有少量小空泡。浅的核窝位于核中侧部。两个中心粒相互成125角,位于核窝内。中片由袖套和鞭毛起始段。袖套不对称,含有少量细胞质,圆形或杆状弯曲的线粒体集中于袖套一侧,另一侧仅剩余一层很薄的细胞质。鞭毛长29.32±1.98μm,宽242.56±19.27nm,偏于核一侧。鞭毛轴丝的微管为“9×2+2”模式,但在基体与鞭毛的交界处无中央微管呈"9×2+0”模式。此外轴丝外侧分布有大小不一的囊泡。根据观察结果,绘制了斑马鱼精子结构模式图。斑马鱼精子具有鲤科鱼类精子的一般特征,但仍存在种间差异。这些特征有助于与其它物种的比较研究,同时为精子质量评估提供参考。实验Ⅶ斑马鱼精巢TLR2和TLR4的表达研究应用免疫组织化学反应(IHC)研究不同温度条件下,斑马鱼精巢TLR2和TLR4的表达分布情况。斑马鱼分别饲养于低温(10-15℃)和常温(25-30℃)条件下。结果显示,常温下斑马鱼精巢TLR2和TLR4阳性反应微弱;而低温条件下精巢生精小管边缘的间质及支持细胞TLR2阳性反应强烈,精原细胞和支持细胞中也出现TLR4阳性反应。这一结果表明低温可引起斑马鱼精巢TLR2和TLR4表达提高,增强斑马鱼精巢固有免疫能力。