猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）可导致断奶仔猪综合征和其他临床疾病,包括猪繁殖障碍、皮炎和肾病综合征、坏死性气管炎、胎儿心肌炎以及先天性震颤。目前,疫苗免疫是养殖企业防控PCV2感染的主要方式。PCV2疫苗以灭活疫苗和亚单位疫苗为主。PCV2的亚单位疫苗通过基因工程手段大量生产PCV2 Cap蛋白,但也存在生产成本高、纯化困难、内毒素残留等问题。灭活疫苗多由PK-15细胞培养的病毒灭活而来,但是目前的培养工艺中存在病毒增殖较慢,病毒含量低等问题,严重限制了灭活疫苗的生产技术水平。为降低PK-15细胞在培养PCV2病毒抗原中存在的细胞抗病毒应答,提高病毒增殖效价,本研究应用CRISPR/Cas9基因编辑技术对PK-15细胞基因组上的关键抗病毒基因之一的进行敲除,构建viperin基因缺失的PK-15细胞系,探索PCV2病毒在viperin基因缺失的PK-15细胞中高效增殖模式。Viperin蛋白是I型干扰素（IFN-I）中的一种,被证明有广泛的抗病毒作用。它定位于内质内膜,可以干扰病毒病毒粒子复制和抑制病毒的繁殖。本实验参考NCBI数据库中猪Viperin基因序列,分别设计了针对基因中3组外显子序列的引物。通过PCR扩增PK-15细胞基因组并测序,分别获得529bp、385bp和639bp长度的外显子序列。根据3组外显子序列分别设计并合成多组g RNA。通过分子克隆技术将各组g RNA退火后分别插入到p X459质粒中构建工具质粒,并进行测序验证。建立PK-15细胞脂质体转染方法,并优化转染条件。将携带不同外显子g RNA的p X459工具质粒两两组合,分别转染PK-15细胞,并通过嘌呤霉素进行压力筛选。收集抗生素筛选后生长出的细胞,分别通过PCR扩增和测序分析对viperin基因缺失情况进行初步鉴定,CRISPR/Cas9技术能准确和高效的编辑PK-15细胞基因,抗生素压力筛选辅助下,其编辑效率可达87.5%。通过等比例接种PCV2对各组的细胞功能进行比较验证,选择第二组外显子敲除细胞进一步单克隆纯化和鉴定,最终获得两株viperin基因缺失细胞克隆,将这两株细胞命名为PK-15-vip1细胞株和PK-15-vip2细胞株。通过对细胞生长状态观察、生长曲线等试验,发现基因缺失后的细胞株的活力较强,增值的速度较快。PCV2感染试验证明应用PK-15-vip1细胞培养PCV2的病毒效价较野生型细胞株有显著提高,而PK-15-vip2细胞的病毒增殖效价较PK-15野生型细胞效价差别不显著。对PK-15-vip1细胞和PK-15野生型细胞培养的PCV2病毒Cap基因分别测序并比较,发现viperin基因缺失对PCV2病毒的Cap蛋白遗传稳定性没有影响。本研究通过CRISPR/Cas9技术成功构建viperin缺失基因PK-15细胞株,在此基础上成功将该细胞用于PCV2增殖的研究上,初步取得较好的效果,为进一步开展抗病毒蛋白研究、PCV2高效增殖细胞株研发等提供了技术依据。