癌症是世界上仅次于心脑血管疾病的第二大致死性疾病,严重地威胁人类的健康和生命,现在临床上应用的抗癌药物虽然不少,但价格昂贵,毒副作用严重,且尚没有治疗癌症的特效药。二萜类化合物紫杉醇(Taxolò)自1971年由美国学者Dr.Wall从太平洋红豆杉(Taxus brevifolia)的树皮中纯化得到的抗肿瘤活性成分后,紫杉醇很快应用于多种常见恶性肿瘤,并取得了显著的效果,成为抗癌的主要明星药物。但由于紫杉醇取自红豆杉属植物的树皮,红豆杉属全世界仅有11种,生长极为缓慢,且紫杉醇在树皮中的含量又很低,极大地限制了紫杉醇的临床应用。为此,本研究以从加拿大红豆杉可再生小枝和针叶中分离纯化的59种紫杉烷类化合物为研究对象,检测了它们对人肝肿瘤细胞增殖的作用,筛选出四种可明显抑制人肝肿瘤细胞增殖的化合物,并对化合物9,10-deacetyl-taxinine抗肿瘤的作用机制进行了初步探讨,这对于扩大紫衫药源,寻找和开发新的抗癌先导化合物或药物都具有非常重要的意义。第一部分加拿大红豆杉中紫杉烷类化合物抗肝癌活性筛选目的:为了缓解临床对于紫杉醇供不应求的局面,寻找抗肿瘤活性强,毒副作用低的紫杉烷类化合物,本研究对加拿大红豆杉可再生枝叶中纯化的59种紫杉烷类化合物为实验对象,对人肝肿瘤细胞增殖抑制活性进行了筛选,为研发高效低毒抗肿瘤新药提供具有开发前景的候选化合物。方法:应用MTT比色法进行活性筛选。人肝癌细胞(BEL-7402细胞)接种于96孔板,每孔含1×104个细胞,分别加入溶剂对照(终浓度0.1%DMSO)、阳性对照顺铂、紫杉醇和59种加拿大红豆杉中纯化的单体化合物,终浓度为10μmol/L,每组设3复孔,置于饱和湿度、37℃和5%CO2培养箱中培养48 h。于培养结束前4 h,各培养孔加入5 mg/m L MTT。实验终止测定各孔光密度值(OD值),测定波长λ=570 nm,参考波长λ=630 nm,并计算细胞存活率,细胞存活率(%)=(给药组OD值/对照组OD值)×100;实验用化合物对肿瘤细胞的浓度-效应曲线用Hill数学模型拟合,计算实验用化合物的半数抑制浓度(IC50)值。结果:10μmol/L的顺铂和紫杉醇作用于人肝肿瘤细胞(BEL-7402)后,均显示了非常强的增殖抑制活性,加拿大红豆杉中纯化的59种紫杉烷类化合物对人肝肿瘤细胞的增殖抑制活性的筛选结果为:用10μmol/L的化合物7-epi-10-deacetyltaxol(5)、9,10-deacetyl-taxinine(19)、2a,10b-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicinⅡ(29)和2a,9a-diacetyl-5-cinnamoylphototaxicin II(30)处理BEL-7402细胞时,对BEL-7402细胞的增殖显示较强抑制活性,肿瘤细胞生存率分别为9.14%、8.06%、10.38%和9.19%;其他的实验用紫杉烷类化合物对人肝癌细胞的增殖显示较弱或不显示抑制活性。通过肿瘤细胞增殖生存率对化合物5、19、29和30浓度的对数回归方程,得到四种化合物对BEL-7402细胞增殖的IC50,分别为1.20、1.24、1.78和2.32μmol/L,阳性对照Taxol对BEL-7402细胞增殖的IC50为4.79μmol/L。结论:加拿大红豆杉中纯化的紫杉烷类化合物7-epi-10-deacetyltaxol(5)、9,10-deacetyl-taxinine(19)、2a,10b-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicinⅡ(29)和2a,9a-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicin II(30)对人肝癌细胞具有较强的抑制活性。第二部分加拿大红豆杉中紫杉烷类化合物抗癌活性及构-效关系研究目的:随着近年来对紫杉醇及其前体物的需求量不断攀升,为了缓解紫杉醇供不应求的局面,本研究以加拿大红豆杉可再生枝叶中分离纯化的4种对人肝癌细胞有明显抑制活性的紫杉烷类化合物的抗癌活性及构-效关系进行了研究探讨,从化学角度解释具有较强抗肿瘤细胞的分子结构基础。方法:采用MTT比色法观察7-epi-10-deacetyltaxol(5)、9,10-deacetyl-taxinine(19)、2a,10b-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicinⅡ(29)和2a,9a-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicin II(30)对BEL-7402细胞、SMMC-7221细胞、Hep G2细胞及HLE细胞的增殖抑制活性,具体方法与第一部分相同。运用Chem Office软件MM2分子力学模型,对化合物19分子结构的最小能量化三维构象进行研究,结果:没有侧链的紫杉烷化合物显示较弱或不显示抑制肿瘤细胞增殖活性;苯基异丝氨酸侧链连接在13位碳原子上的紫杉烷类化合物,抗肿瘤活性显著增加;5位碳原子上具有的脂溶性肉桂酰基侧链的紫杉烷类化合物与抗肿瘤活性有一定的相关;且这种相关性在从红豆杉科植物中得到的3位和20位碳原子重排后形成的三环紫杉烷类化合物中以及二环的紫杉烷类化合物以及含有氧环的紫杉烷化合物中得到了印证;化合物19分子的最小能量化构象与紫杉醇的最小能量化三维立体构象非常相似。用10μmol/L的化合物7-epi-10-deacetyltaxol(5)、9,10-deacetyl-taxinine(19)、2a,10b-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicinⅡ(29)和2a,9a-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicin II(30)分别处理BEL-7402、SMMC-7221、Hep G2和HLE细胞,对其增殖均显示出较强的抑制活性;得到得到四种化合物对BEL-7402细胞增殖的IC50,分别为1.20、1.24、1.78和2.32mmol/L;对SMMC-7221细胞增殖的IC50,分别为6.27、30.91、0.81和55.34mmol/L;对Hep G2细胞增殖的IC50,分别为0.52、6.27、4.91和20.09mmol/L;对HLE细胞增殖的IC50,分别为29.32、42.51、18.06和61.24mmol/L。结论:抗人肝癌细胞不仅与紫杉烷类化合物的骨架结构密切关系,而且该类化合物抗人肝癌细胞可能还与5位碳原子具有的肉桂酰基侧链有一定的相关;加拿大红豆杉中纯化的紫杉烷类化合物7-epi-10-deacetyltaxol(5)、9,10-deacetyl-taxinine(19)、2a,10b-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicinⅡ(29)和2a,9a-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicin II(30)具有广谱抗肿瘤活性。第三部分9,10-deacetyl-taxinine抗人肝癌作用机制研究目的:在发现紫杉烷类化合物7-epi-10-deacetyltaxol(5)、9,10-deacetyltaxinine(19)、2a,10b-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicinⅡ(29)和2a,9a-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicin II(30)对肝癌细胞具有广谱且抗增殖明显的基础上,首次对9,10-deacetyl-taxinine是否对肝癌细胞产生了凋亡效果进行了研究。方法;1通过荧光素酶报告基因检测系统进行凋亡信号通路中的相关报告基因Bax-Luc、p G13-Luc、h Noxa-Luc和p21-Luc以及胞内其他信号通路的相关报告基因Ig K-Luc、SRE-Luc、CRE-Luc和NFAT-Luc:的表达的检测;2 TUNEL细胞凋亡检测法定性检测化合物19对BEL-7402细胞作用24h后的细胞凋亡状况;3流式细胞术定量检测化合物对19对BEL-7402细胞作用24h后的细胞凋亡状况;4 Western blot检测上述化合物对19作用BEL-7402细胞后,肿瘤细胞内的5种蛋白因子Caspase-3、Bax、Bcl-2、HSP和P53变化;5 MTT法检测Caspase抑制剂Z-VAD-FMK对9,10-deacetyl-taxinine抑制人肝癌细胞BEL-7402的增殖翻转作用。结果：1以10μmol/L浓度的四种紫杉烷类化合物5、19、29和30处理BEL-7402细胞后,观察了对BEL-7402细胞报告基因的表达。结果显示,对于BEL-7402细胞,化合物19可明显上调其细胞内p53依赖的凋亡信号通路中相关的报告基因Bax-Luc、p G13-Luc、h Noxa-Luc和p21-Luc的表达,但对另外的信号通路相关的报告基因如SRE-Luc、Ig K-Luc、CRE-Luc和NFAT-Luc,则无明显作用显示,而另外的三种化合物对相关报告基因均未显示出诱导作用。2 10mmol/L的化合物19处理BEL-7402细胞,于24 h后进行流式细胞仪检测,结果显示BEL-7402细胞早期凋亡率为12.23%,与空白对照组4.1%比较,具有显著性差异(P<0.05),提示化合物19具有诱导BEL-7402细胞凋亡的作用。3 TUNEL实验显示化合物19的结果为阳性;4化合物19对BEL-7402细胞内的Bax蛋白、p53蛋白和Caspase-3蛋白的表达有上调作用:用10μmol/L顺铂和化合物19作用于BEL-7402细胞后,显示为细胞内的p53、Bax和Caspase-3表达水平均显著上升。5 Caspase抑制剂Z-VAD-FMK对9,10-deacetyl-taxinine抑制BEL-7402细胞增殖的翻转作用:0.1、1、10μmol/L的顺铂和化合物19处理BEL-7402细胞后,肿瘤细胞生存率分别为94.59%、64.39%、33.56%和65.82%、35.41%、1.87%;Z-VAD-FMK(20μmol/L)与顺铂和化合物19共同处理BEL-7402细胞后,其细胞生存率分别上升为100.00%、72.19%、40.63%和85.97%、40.15%、6.53%。Z-VAD-FMK能显著翻转化合物19对于BEL-7402细胞的抑制作用。6化合物19处理BEL-7402细胞后引起了BEL-7402细胞内的HSP90a降低。结论：1.加拿大红豆杉中纯化的紫杉烷类化合物7-epi-10-deacetyltaxol(5)、9,10-deacetyl-taxinine(19)、2a,10b-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicinⅡ(29)和2a,9a-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicin II(30)具有较强的抑制BEL-7402细胞增殖的作用。2.抗人肝癌细胞不仅与紫杉烷类化合物母核骨架结构密切关系,还与C-5上连接的肉桂酰基侧链以及连接羟基的数目有一定的相关。3化合物19通过诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡而发挥抗瘤活性。4 9,10-去乙酰紫杉宁可通过p53通路发挥抗人肝癌活性,使p53表达增加,进而促进Bax表达增加,抑制Bcl-2表达,进一步引起Caspase-3表达增加,引起细胞凋亡。5.9,10-去乙酰紫杉宁处理的BEL-7402细胞中,HSP90a在其抗瘤过程中发挥了作用。