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骨髓造血微环境为造血细胞的发育成熟提供了一个良好的场所,其中骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell,BMSC)起着重要作用,BMSC除直接作用于造血细胞外,其表面的黏附分子可促使造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell, HSPC)与BMSC以及微环境中的细胞外基质相互黏附,进而促进造血细胞的增殖分化。血管细胞黏附分子-1 (vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1,CD106)及细胞间黏附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1,CD54)主要在BMSC上表达,可介导BMSC与HSPC的黏附,利于造血细胞的分化成熟,同时在一些细胞因子作用下还参与HSPC的动员和归巢。BMSC还可分泌一些细胞因子调控造血,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是BMSC分泌的一种糖蛋白,可以刺激血管内皮细胞的增殖、移行,提高血管的通透性,促进新生血管形成。辐射会对机体造成损害,尤其是造血系统更易受损。辐射损伤后BMSC细胞数明显减少,大多被阻滞于G0/G1期;细胞增殖能力受损,使得BMSC形成成纤维细胞集落(colony forming unit-fibroblast, CFU-F)能力明显下降;辐射损伤还可增加BMSC的凋亡率;另外辐射损伤还会影响BMSC表面黏附分子的表达以及抑制其细胞因子的分泌,使BMSC调控造血的功能抑制,最终导致造血功能障碍。辐射防护剂的研究已开展多年,以往的化学辐射防护剂由于毒副作用大而影响其效果,因此期待开发出毒性较小、可用于临床的中药辐射防护剂。当归是一种活血化瘀中药,主要成分为当归多糖(angelica polysaccharide,APS),研究表明,APS可促进急性辐射损伤小鼠外周血象和淋巴细胞数量的恢复,提高组织的抗氧化能力,具有一定的抗辐射功能,但APS对辐射损伤后骨髓基质细胞的作用尚未见报道。基于此,我们以BMSC细胞周期、CFU-F数量、细胞凋亡率、表面黏附分子CD54、CD106以及VEGF mRNA的表达变化为切入点,研究APS促进辐射损伤小鼠造血功能恢复的可能机制。本实验中动物模型的建立均采用直线加速器全身照射BALB/c小鼠,研究APS对辐射损伤小鼠BMSC表面黏附分子表达及其血管生长因子表达的影响,为进一步探讨APS作为一种辐射防护剂应用于临床提供新的实验依据。目的:研究APS对急性放射损伤小鼠BMSC增殖能力、细胞凋亡率及表面黏附分子和血管内皮生长因子表达的影响,进而深入了解APS促进辐射损伤后骨髓造血功能恢复的分子机制。方法:1. BALB/c小鼠随机分为4组:正常组不作任何处理。其余BALB/c小鼠全身均匀照射X射线,总剂量4.0 Gy,时间1.33min,照射后按给予不同药物和剂量分为生理盐水(saline,NS)组、2 mg/kg APS组和8 mg/kg APS组。2.常规方法计数外周血WBC、RBC、PLT及单根股骨骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cell,BMNC)。3.常规方法培养BMSC,观察小鼠BMSC的贴壁情况及细胞80%贴壁时间。4.常规方法培养BMSC,计数各组CFU-F数。5.流式细胞术检测放射损伤小鼠BMSC细胞周期的变化以及APS对它的影响。6流式细胞术检测APS对放射损伤小鼠BMSC凋亡率的影响。7.流式细胞术检测APS对放射损伤小鼠BMSC黏附分子CD54和CD106表达的影响。8. RT-PCR方法检测APS对放射损伤小鼠BMSC的VEGF mRNA表达水平的影响。结果:1.急性放射损伤模型的建立:小鼠照射后表现为饮水、进食均减少,行动迟缓,嗜睡,皮毛略凌乱,光泽性差,偶尔会有腹泻,小鼠之间相互靠拢。2.外周血WBC、RBC、PLT及BMNC的变化:照射后7,14,21d NS组小鼠外周血各指标及BMNC较正常组均降低(P<0.05);同时间点APS组较NS组WBC、PLT及BMNC下降幅度小,恢复快(P<0.05),第14,21d 8 mg/kg APS组WBC比2 mg/kg APS组恢复快(P<0.05),同时间点8 mg/kg APS组BMNC数均明显高于2 mg/kg APS组(P<0.05),各指标仅21d 8 mg/kg APS组恢复正常;照射后小鼠第7d APS组较NS组RBC下降幅度大(P<0.05),但恢复快,第14d的8 mg/kgAPS组和第21d的2 mg/kg APS组RBC开始升高,且8 mg/kg APS组在第21d已恢复至正常水平。3. BMSC生长达80%贴壁时间比较:照射后7,14,21d NS组BMSC达80%贴壁时间明显延长,与正常组有显著差异(P<0.05);同一时间点APS组比NS组更快达80%贴壁(P<0.05),但8 mg/kg APS组与2 mg/kg APS组比较BMSC贴壁时间差异不显著,第21d APS组BMSC已恢复正常贴壁能力。4.成纤维细胞集落(CFU-F)数量变化:照射后7,14,21d NS组BMSC培养形成CFU-F数明显少于正常组,差异显著(P<0.05);第7d APS组与NS组比较,CFU-F数量无明显差异,而第14,21d APS组形成的集落数明显高于同时间点的NS组(P<0.05),第7,14 d 8 mg/kg APS组CFU-F数与2 mg/kg APS组相比无明显差异,第21d 8 mg/kg APS组CFU-F数显著多于2 mg/kg APS组(P<0.05),与正常组无明显差异。5. BMSC细胞周期的变化:照射后7,14,21d NS组BMSC多数处于G0/G1期,S期合成减少,与正常组相比差异显著(P<0.05);第7 d不同组间相比G0/G1期无差异,第14,21d APS组G0/G1期细胞所占比例明显低于NS组(P<0.05),同时间点2 mg/kg APS组与NS组相比S期均无明显改变,但8 mg/kg APS组比NS组S期合成明显活跃(P<0.05);第14,21d 8 mg/kg APS组与2 mg/kg APS组相比细胞周期各时相比例恢复更快(P<0.05),第21d恢复正常。6. BMSC细胞凋亡率的改变:照射后第7,14,21d NS组BMSC细胞凋亡率较正常组均明显增高(P<0.05);同一时间点APS组较NS组细胞凋亡率减少(P<0.05),但2 mg/kg APS组与8 mg/kg APS组比较无明显差异,第21d APS组细胞凋亡率已降至正常水平。7. BMSC表面黏附分子CD54和CD106的表达变化:照射后第7,14,21d NS组BMSC表面黏附分子CD54和CD106阳性率较正常组明显降低(P<0.05);同一时间点APS组较NS组CD54和CD106阳性率高,差异显著(P<0.05),但同时间点8 mg/kg APS组与2 mg/kg APS组相比,CD54阳性率差异不明显,而8 mg/kg APS组的CD106阳性率要高于2 mg/kg APS组,有显著性差异(P<0.05),第21d APS组的CD54和8 mg/kg APS组的CD106已恢复至正常水平。8. BMSC VEGF mRNA表达的变化:照射后第7,14,21d NS组BMSC VEGF mRNA表达较正常组显著降低(P<0.05);同一时间点APS组VEGF mRNA均明显高于NS组(P<0.05),8 mg/kg APS组与2 mg/kg APS组之间差异不明显,第21d APS组已恢复至正常。结论:APS对辐射损伤小鼠骨髓基质细胞具有保护作用,进而促进造血功能的恢复;其作用机制可能是APS促进BMSC的增殖能力,降低细胞凋亡率,上调BMSC黏附分子CD54、CD106的表达从而增强细胞间黏附能力,刺激BMSC的VEGF分泌,促进新生血管生成,以利于受损造血微环境的恢复,为造血干/祖细胞的增殖分化提供一个良好的发育环境。本实验结果为APS作为辐射防护剂的临床应用提供新的理论依据。