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骨癌痛(Bone cancer pain,BCP)是一种由于骨肿瘤原发性生长,或肿瘤继发性骨转移引起的复杂的顽固性癌痛,目前在临床中尚缺乏有效的治疗方法,严重影响着肿瘤患者的生活质量。因此深入研究BCP发病机制,为BCP的临床治疗提供高效、可行的方案,将具有重要的临床意义。突触重塑是指突触的结构或功能发生变化,引起突触间传递效率的改变。AMPAR作为重要的谷氨酸受体,介导了绝大多数兴奋性突触传递,Glur1是AMPAR中最重要的亚基,其磷酸化水平发生改变可引起AMPAR在突触膜上的移动和转移,同时增强受体通道的电导性,影响突触之间的传递效率,介导突触重塑。研究发现,突触重塑在疼痛传导和调节中发挥重要作用,发生于脊髓层面的突触重塑诱发的中枢敏化,是骨癌痛发生的重要机制之一。近年来研究发现,细胞外基质分子(Extracellular matrix,ECM)可参与机体慢性疼痛调节过程,且ECM可通过调节树突棘和突触结构的稳定性和可塑性介导突触重塑。核心蛋白多糖(decorin)作为含量最丰富的ECM蛋白之一,广泛参与机体抗炎性反应、抗纤维化、抗肿瘤等生理和病理过程,同时在神经系统中,decorin可促进神经元突起的分化和生长,以及促进受损神经组织中轴突的再生,但decorin在突触重塑中的具体作用尚不清楚。我们课题组前期关于BCP大鼠全基因组芯片结果显示,在BCP发病过程中,decorin表达量明显升高,提示decorin可能参与了BCP的发生。本课题共分为两部分,在第一部分中,我们首先构建大鼠BCP模型,研究decorin在BCP形成中的作用及可能的机制;在第二部分中,我们通过体外培养原代神经元,研究decorin在神经元突触重塑中的作用,进一步探究BCP的发病机制。第一部分:Decorin调节Glur1磷酸化诱发骨癌痛目的:BCP是临床中难治性疼痛,目前其发病机制尚不完全清楚。本研究旨在探究decorin在BCP形成中的作用及可能的作用机制。方法:选取48只雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠,随机均分为四组:对照组(sham)、骨癌痛组(BCP)、骨癌痛+阴性对照病毒组(BCP+shctrl)、骨癌痛+干扰病毒组(BCP+shdecorin),每组12只大鼠。在大鼠胫骨骨髓腔中种植Walker256乳腺癌细胞构建BCP模型,其中BCP+shctrl组和BCP+shdecorin组在BCP建模当天,分别于脊髓背角注射shctrl和shdecorin慢病毒。建模前一天(0 d)、建模后第3、5、7、10、14和21天检测各组大鼠机械刺激缩足阈值(Paw Withdrawal Mechanical Threshold,PWMT),以评估大鼠疼痛阈值的变化。第3周时取大鼠右侧胫骨和脊髓L 4-L 6段腰膨大,用HE染色观察各组大鼠胫骨中肿瘤细胞侵犯骨组织情况;用免疫荧光标记法检测decorin在大鼠脊髓中的表达定位情况;RTPCR和Western blot检测大鼠脊髓腰膨大中decorin、Glur1、p-Glur1-ser 831含量变化。结果:Sham组大鼠右下肢未见肿瘤生长,HE染色骨组织未见肿瘤侵犯,BCP组大鼠有抬足、舔爪及跛行等行为表现,HE染色胫骨组织中有大量的肿瘤细胞,且骨质被严重侵犯。PWMT测定结果显示,与sham组比较,建模后第7天,BCP组大鼠PWMT明显下降(P<0.05),且随着时间进展,下降程度更为显著;与BCP组比较,BCP+shctrl组大鼠PWMT未发生明显改变(P>0.05),BCP+shdecorin组大鼠PWMT显著升高(P<0.05)。免疫荧光结果显示decorin在脊髓灰质中大量表达,且在BCP组脊髓背角中表达量上调;定量结果显示,和sham组相比较,decorin表达量在BCP组脊髓中增加(P<0.05);与BCP组比较,decorin表达量在BCP+shdecorin组中明显降低(P<0.05)。与sham组相比,BCP组中Glur1含量未发生改变(P>0.05),p-GluR1-ser 831含量显著升高(P<0.05);与BCP组比较,BCP+shdecorin组中Glur1未发生改变(P>0.05),p-GluR1-ser 831表达量显著减低(P<0.05)。结论:在本研究条件下发现,decorin参与大鼠BCP的发生,且decorin表达量上调后通过促进Glur1磷酸化,诱导大鼠BCP的发生。第二部分:干扰Decorin表达抑制兴奋性突触重塑目的:研究decorin在神经元突触重塑中的作用,进一步探究BCP发病机制。方法:原代培养大鼠皮层神经元,将神经元随机分为三组,正常组(normal)、阴性对照病毒组(shctrl)和干扰病毒组(shdecorin)。在神经元培养至第3天时转染慢病毒,48小时后观察病毒转染效果,培养至第7天时采用RT-PCR检测病毒干扰效果,培养至第12天时用免疫荧光标记法检测神经元树突棘、兴奋性突触形成情况和Glur1、p-Glur1-ser 831含量变化。结果:免疫荧光结果显示decorin在神经元胞体和分支中均有表达,定量结果显示与normal组相比,shctrl组中decorin含量未发生改变(P>0.05),shdecorin组中decorin表达量明显下降(P<0.05)。与shctrl组相比,shdecorin组中神经元树突棘密度(P<0.05)及兴奋性突触数目(P<0.01)减少;突触后膜中Glur1含量未发生改变(P>0.05),p-Glur1-ser 831含量减少(P<0.01)。结论:在本研究条件下发现,干扰神经元中decorin的表达,可以抑制兴奋性突触重塑。