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稻麦的胚乳占籽粒重量的90%左右,主要贮藏物质为淀粉和蛋白质。淀粉和蛋白质分别在淀粉体和蛋白体内积累,研究稻麦胚乳淀粉体和蛋白体发育的规律,对改善稻麦籽粒的品质,提高籽粒产量具有重要意义。本文以水稻(OryzasativaL.)品种“扬稻6号”和小麦(TriticumaestivumL.)品种“扬麦16号”为材料,采取精确标记颖果发育天数,运用组织化学、光学显微镜和电子显微镜(扫描电镜、透射电镜)相结合的观察技术,研究了稻麦胚乳细胞结构特点和发育特性,重点观察了淀粉体和蛋白体发生发育的过程,研究结果将充实细胞生物学、形态解剖学、作物生理学等学科知识,为稻麦品质改良和粮食生产提供基础理论。主要研究结果如下:
1.稻麦颖果的发育。
水稻在开花后颖果长度增长最明显,至花后10d颖果形状基本定型。小麦颖果生长较缓慢,颖果发育至成熟持续的时间较水稻长,花后约30d以后颖果形状基本维持不变。
水稻颖果在发育初期子房壁中积累的淀粉较多,淀粉粒消失的时间也较晚,胚乳I2-KI染色随着发育天数而逐渐加深,小麦颖果在花后花后第6d起胚乳开始积累淀粉,果皮厚度随开花天数的增加逐渐变薄,果皮中的淀粉随着胚乳的发育而逐渐消失。水稻颖果的维管束、胚和胚乳表层细胞脱氢酶活性较强,维持时间也较长。内胚乳在花后10d以后脱氢酶活性已经明显降低,当灌浆趋向停止时不再具有。小麦腹部维管束和果皮在颖果发育早期具有较强的呼吸活性,腹部维管束被TTC染成深红色,表明此时的呼吸活性很高,胚乳在花后17d以后TTC染色逐渐消失,在发育后期呼吸活性变弱。
2.水稻和小麦颖果鲜/干重随着花后天数,呈“S”曲线增长,即前期增长较慢,中间增长迅速,后期增长趋势逐渐减缓。
3.水稻开花后颖果呼吸速率一开始维持在较高的水平,随着发育天数的增加,呼吸速率迅速下降,15d后,慢慢停留在一个稳定的低水平上。小麦前期呼吸速率下降较快,花后5d到花后20d迅速下降,从花后20~30d经历一个缓慢下降的过程,花后30~35d呼吸速率又迅速降低。
4.不同固定和染色方法对稻麦胚乳细胞结构显示的影响。
GA-OsO4固定法能较好保存稻麦胚乳细胞的结构,能清晰的显示胚乳细胞中的淀粉体、蛋白体、内质网、液泡等细胞器,高锰酸钾固定法对细胞中膜结构细胞器的被膜显示较好。对这两种固定方法的花后不同发育天数的水稻胚乳细胞半薄切片采用TBO,希夫(Schiffs)试剂,多色性染液,高碘酸-希夫-甲苯胺蓝-O(PAS-TBO)染色,结果发现:(1)TBO染色的GA-OsO4制样细胞组织结构清晰,淀粉体、蛋白体、细胞壁、细胞核均清晰可见,但液泡膜以及淀粉体被膜不明显。高锰酸钾固定制样的能较好的显示出细胞中内膜结构,如细胞核、液泡的被膜、淀粉体被膜。此外,淀粉体很容易被染色,而其他细胞组织不易被染色。
(2)多色性染液染色的GA-OsO4制样效果良好,而且着色均匀,反差好,组织结构清晰,细胞壁、蛋白体呈蓝色,淀粉体被膜以及淀粉粒之间的膜被染成玫红色。高锰酸钾固定制样染色细胞核呈蓝色,细胞质、间质呈玫红色,胞核、核膜及染色质清晰可辨,但淀粉体染色效果不好,着色不均匀。
(3)用PAS法染色的GA-OsO4制样能将淀粉体染成玫红色,结构较清晰,而其他细胞器很难被染色。高锰酸钾固定制样用PAS法染色能较好的显示出胚乳细胞壁、蛋白体、淀粉体、淀粉体被膜、淀粉粒之间膜结构,染色效果较GA-OsO4制样好。
(4)PAS-TBO复染的GA-OsO4固定的样品,原先没有被PAS染色的胚乳细胞壁、蛋白体、细胞基质、细胞核都被TBO染色显示。TBO的复染弥补了PAS对GA-OsO4固定样品的染色不足。PAS-TBO复染的高锰酸钾固定制样,淀粉体染色过深,无法得到清晰的照片。
总体上GA-OsO4固定制样的细胞结构要优于高锰酸钾固定液制样,其中TBO和多色性染色效果较好,呈色丰富。对小麦的半薄切片采用TBO,Schiffs试剂,多色性染液,考马斯亮蓝,PAS-TBO染色,结果发现GA-OsO4固定,TBO,多色性染液,Schiffs试剂,考马斯亮蓝染色的半薄切片染色效果比高锰酸钾固定的好,而PAS-TBO复染则是高锰酸钾固定制样的较好,不仅淀粉粒呈玫瑰红色,而且细胞壁、内质网、蛋白体、淀粉体被膜被染成蓝色,镜观丰富,照片清晰美观。在稻麦胚乳的半薄切片观察中,各染剂的着色侧重点不同,因此在染色剂的选择时则要根据观察对象的不同而选择相应的染色方法。
在这两种固定方法的超薄切片观察中,GA-OsO4固定法能较好的保存胚乳细胞超微结构,但淀粉体被膜不明显,反差弱。高锰酸钾固定制样不利于对胚乳细胞超微结构整体观察,因为其对细胞基质和各种细胞器基质固定较差,但对膜结构保存良好。如叶绿体被膜和片层结构、淀粉体被膜、小麦大淀粉体内片层膜结构等。本文利用该固定方法观察了稻麦胚乳淀粉体发育增殖及胚乳细胞发育中内质网的生理活动,获得了较满意的结果
5.稻麦胚乳淀粉体的发生发育以及增殖方式。
水稻胚乳淀粉体一般是由原生质体转化而来的。本文在观察淀粉体增殖的过程中采用戊二醛-锇酸(GA-OsO4)固定制样和高锰酸钾固定制样两种方法。GA-OsO4固定法能较好的保存胚乳细胞超微结构,但淀粉体被膜不明显,反差弱。高锰酸钾固定制样不利于对胚乳细胞超微结构整体观察,因为其对细胞基质和各种细胞器基质固定较差,但对膜结构保存良好。基于这两种不同固定方法的特性,观察淀粉体增殖的重点在于淀粉体被膜的变化,因此,高锰酸钾固定制样是此项研究的主要方法。
根据淀粉体被膜的变化,将水稻淀粉体的增殖方式划分为出芽增殖、缢缩分裂增殖、中间隔板增殖、淀粉体被膜内陷成小泡增殖、淀粉体内外膜腔膨大增殖。其中出芽增殖和缢缩分裂增殖较为常见,是胚乳细胞发育前期淀粉体增殖的主要方式。中间隔板增殖有两种方式,第一种是指某一处的淀粉体被膜向淀粉体基质中凹陷,形成单向的袋装被膜隔板,当被膜隔板触及到原淀粉体被膜时,将淀粉体分裂成两个淀粉体单元,达到增殖目的。另一种是淀粉体被膜相向内凸伸长,直到接触并融合,形成双层膜中间隔板,然后沿中间隔板将原淀粉体分裂成两个新淀粉体。在淀粉体增殖过程中,可以观察到一个淀粉体可以同时进行两种甚至多种增殖方式。
小麦胚乳有大小两种淀粉体,花后6d起,胚乳细胞中的原生质体开始积累淀粉转变成淀粉体,1个淀粉体内可以同时积累2个或多个淀粉粒,大淀粉体可以通过出芽或缢缩增殖,本文用两种固定方法都观察到了大淀粉体这两种增殖方式。
花后8~14d,大淀粉体被膜向内凹陷形成基质浓密小泡,或向细胞基质突出,然后这些突起与淀粉体分开,形成新的淀粉体,即小淀粉体。花后16d,胚乳中小淀粉体逐渐增多,小淀粉粒除了在大淀粉体内积累以外,自身还可以发生缢缩增殖和中间隔板方式分裂增殖。
6.稻麦胚乳蛋白体的形成和积累。
水稻胚乳蛋白体有两种类型,蛋白体Ⅰ(proteinbodyⅠ,PbⅠ)由粗面内质网(RER)发育而来,呈球形,表面附有核糖体或多聚核糖体,在剖面上呈现同心圆状的轮纹结构,可能是包裹它的RER向内分泌本身合成的蛋白质并从内向外积累而形成。已成形的PbⅠ通常有一不连续的单层核糖体被膜包被,一些含蛋白质基质的小泡融合到PbⅠ上,使PbⅠ体积不断增大。蛋白体Ⅱ(proteinbodyⅡ,PbⅡ)由液泡发育而来,多呈不规则块状,也有的液泡吞噬蛋白质基质小泡,在自身体内积累蛋白质。当液泡中开始积累蛋白质时,液泡便转化为蛋白贮藏液泡(PSV),在PSV中通常可见贮藏蛋白的晶体结构;花后6d的小麦胚乳细胞中富含PSV,其内出现一个或者多个圆球状的蛋白质颗粒,同时,RER在小麦胚乳蛋白体发育周期中活动也很旺盛,有些RER相互叠加形成闭合的网状RER,而有些则呈环状,在这些RER中的基质的电子致密程度要比细胞基质高,有的RER网腔或末端膨大,积累贮藏蛋白。
稻麦胚乳蛋白大多贮藏在亚糊粉层中,而内胚乳含量较少。
7.用ImageJ分析水稻胚乳淀粉粒表面几何特征的方法。以水稻淀粉粒光学显微镜和扫描电子显微镜图像为研究对象,介绍了图像分析软件ImageJ在淀粉粒表面特征分析中的应用。图像分析结果以轮廓图(outline)和拟合椭圆(Ellipsefitting)两种方式呈现,分析指标选择了面积、周长、长轴、短轴、圆度以及最大切直径。最后还对颗粒图像的获取和图像前处理进行了探讨。
8.关于水稻胚乳中是否存在单粒淀粉体的探讨。该研究分别以花后5d和成熟水稻胚乳半薄连续切片,用GA-OsO4固定法和高锰酸钾固定制样观察水稻花后不同发育天数胚乳细胞超微结构,并以垩白籽粒为对比,用显微和亚显微研究技术对水稻胚乳中是否含有单粒淀粉体进行了探讨,结果发现水稻胚乳中绝大多数的淀粉体为复粒淀粉体,少数为单粒淀粉体。