【摘 要】
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灰黄霉素是一种抗真菌抗生素,临床上被用于治疗皮肤癣菌感染,也可以用作防治农作物真菌病害。本研究的研究对象灰黄青霉D-756是我院吴松刚等自野生菌灰黄青霉4541经多代复合
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灰黄霉素是一种抗真菌抗生素,临床上被用于治疗皮肤癣菌感染,也可以用作防治农作物真菌病害。本研究的研究对象灰黄青霉D-756是我院吴松刚等自野生菌灰黄青霉4541经多代复合诱变获得的灰黄霉素高产突变株,具有很强的利用淀粉类原料能力及耐氯特性,是早期的生产菌株。为了更好地了解生产菌株的细胞运作过程和代谢机制,为进一步改良工业菌株提供指导,我们以突变株D-756为研究菌株,对其进行全基因组测序,了解其灰黄霉素生物合成基因簇和关键调控因子;同时对D-756进行了等离子体诱变选育,期望进一步筛选优良突变株。研究内容如下:1.灰黄青霉D-756的ARTP诱变:采用ARTP(atmospheric and room temperature plasma)诱变仪对D-756菌株进行诱变,大米孢法初筛,重氮盐法测量灰黄霉素的效价。初筛结果表明ARTP诱变的正突变率为19.5%,最佳诱变时间为150s。摇瓶复筛结果显示,突变株3-41的灰黄霉素效价最高,比出发株D-756提高了23%。2.灰黄青霉D-756及野生菌株的发酵产物灰黄霉素的LC/MS(liquid chromatograph-mass spectrometer)分析:采用液质联用(LC/MS)技术对D-756及两株野生菌株的发酵产物进行检测,并考察培养基中氯离子对灰黄霉素合成的影响。比较了D-756与野生菌株4541和40293的发酵产物灰黄霉素的LC/MS图谱,结果显示D-756的灰黄霉素对应的紫外吸收峰面积是两个野生菌的近170倍,该结果与重氮盐法测定的效价结果高度一致;含氯培养基和去氯培养基的D-756发酵产物中灰黄霉素与脱氯灰黄霉素的紫外吸收峰面积比分别为16:1和1:3,说明氯离子对灰黄霉素合成的重要性。3.克隆了突变株D-756与野生菌4541,40293的ITS和18S rDNA序列并进行测序。结果表明D-756,40293,4541三株菌的ITS片段均为545bp,且序列完全一致;三株菌的18S rDNA片段长均为1715bp,其序列相似性均大于99%。将三株菌的ITS和18S rDNA序列在GenBank数据库中进行同源性检索,并构建NJ系统发育树。系统发育分析表明这3株菌高度同源,且与灰黄青霉Penicillium griseofulvum(GU566212.1,NR103892.1,AY373917.1等)聚成一簇。4.灰黄青霉D-756的全基因组测序:采用illuminaHiSeq PE150和PacBio SMRT测序平台进行D-756的全基因组测序。结果表明灰黄青霉D-756基因组由6个scaffolds组成,基因组大小为28.9Mb,GC含量为47.4%,基因6513个,tRNA 188个,rRNA 47个,sRNA 3个,snRNA 44个,各类重复序列8046个。各类基因功能分析显示,灰黄青霉D-756的基因组有众多基因参与运输和分解代谢、信号传导及碳水化合物、氨基酸代谢,提示D-756菌株利用碳、氮源能力及物质交换能力强,具备生产菌株的性能;CAZy功能分析表明,在注释的碳水化合物活性酶中超过60%的酶属于糖苷水解酶类,这很好地解释了D-756发酵生产中强大的利用淀粉类原料的表型。利用已公布的灰黄霉素基因簇的序列比较分析了D-756基因组上该基因簇的组成与排布,发现D-756灰黄霉素基因簇由12个基因组成,其中10个基因在一个簇上,另两个基因在其他scaffold上。该基因簇对D-756合成灰黄霉素的调控机制有待进一步研究。
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