肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种致死率极高的肝脏恶性肿瘤。它的发生通常是以慢性炎症开始,随着炎性细胞因子表达增加,诱导癌基因的活化,进而导致了肝脏损伤,最终促进了肝癌的发展进程。核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)是一种重要的炎性细胞因子,它是联系炎症发展为癌症的重要枢纽。活化的NF-κB进入细胞核内,结合于靶基因上游调控区的NF-κB结合位点,对靶基因的转录进行调控。由于NF-κB的许多下游基因与炎症和增殖相关,因此它的活化能够引起肝癌形成。流行病学统计显示,肝癌的发病率存在性别上的差异。男性的发病率显著高于女性。许多实验研究显示,肝癌的发生与发展很有可能与雌激素(主要是雌二醇)有关。雌二醇能够有效抑制肝细胞癌的病理进程。17β-雌二醇脱氢酶IV(17β-Hydroxysteroid dehydrogenase IV,HSD17B4)是一种在类固醇代谢过程中发挥重要作用的酶蛋白。它能够使具有较高生物活性的雌二醇(Estradiol,E2)灭活,将其氧化为低活性形式的雌酮(Estrone,E1)。HSD17B4通过这种方式调节细胞内E2的分泌量,维持机体雌激素的稳定。最近研究发现HSD17B4在与激素相关的癌症前列腺癌的组织和细胞中表达明显增加。鉴于HSD17B4可降低细胞E2的水平,以及在前列腺癌中的高表达量,我们推测,HSD17B4是否在肝细胞癌中表达也增加?它是否通过降低E2的水平促进了癌症的发展进程?HSD17B4灭活E2促进肝癌细胞增殖与增殖相关基因的活化是否存在关联?为了探讨了上述问题,本实验以HCC大鼠,HCC患者肝脏肿瘤和癌旁组织,以及Hep G2细胞作为研究对象,进行以下三部分研究:一、以肝癌模型大鼠和人肝癌的组织切片为实验对象,观察肝癌组织的HSD17B4表达,分析鼠肝HSD17B4的表达与炎症和增殖相关性。二、在肝癌细胞Hep G2和人肝癌的组织切片中,验证了HSD17B4是NF-κB下游靶基因,证实炎症状态下HSD17B4的表达上调,灭活了雌二醇而促进了Hep G2细胞的增殖。三、HSD17B4通过灭活E2促Hep G2细胞的增殖与信号传导子及转录激活子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)的激活有关。本研究旨在为HCC的发生发展提供新的视角,为HSD17B4作为HCC防治新靶点的研究打下基础。第一部分大鼠肝癌组织中HSD17B4的表达与炎症和增殖的相关性目的:检测HCC大鼠肝组织中HSD17B4表达和活性,以及炎性因子、增殖相关基因的表达;并结合相关性分析评价HSD17B4与炎症、增殖的关系。方法:1利用2-乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine,DEN)诱导产生大鼠肝癌模型。2 HE染色检测肝脏损伤程度。3 Western blotting检测p-Akt、p-MEK、p-ERK以及HSD17B4的蛋白表达。4免疫组化检测HSD17B4在大鼠肝脏以及肝癌患者肝脏中的表达。5 Real-time PCR检测HSD17B4,炎性因子IL-6、TNF-α,以及增殖基因cyclin D1、PCNA的m RNA表达。6放射免疫分析检测E2的改变。7用spearman correlation test对HSD17B4与炎性因子、增殖基因进行相关性分析。结果:1大鼠肝癌模型的建立大鼠肝脏组织经HE染色镜检,可见HCC组的肝细胞变性、坏死,癌细胞具有多形性和明显异型性呈多角型,核大且染色较深。大鼠血液生化指标检测结果显示,大鼠肝功能呈恶化趋势。检测了与炎症和增殖相关的两条信号通路Akt以及MEK/ERK活化水平。HCC组大鼠肝脏Akt,MEK以及ERK的磷酸化水平较NC组相比明显增加。以上结果说明,大鼠肝癌模型成立。2 HSD17B4在HCC组大鼠肝癌组织及人HCC肝癌组织中表达增加Western blotting和免疫组化的检测结果显示,HCC组HSD17B4的表达量显著高于NC组,为NC组的2倍。HSD17B4 m RNA水平HCC组显著高于NC组3.5倍。人HCC肝脏肿瘤和癌旁组织免疫组化结果显示,HSD17B4在肿瘤组织中的表达显著高于癌旁组织。说明,HSD17B4在肝癌组织中表达增加。3大鼠肝组织和血清中E2水平降低放射免疫的结果显示HCC组较NC组肝脏和血清E2的水平均明显降低。说明,HCC组大鼠肝脏中HSD17B4不但表达增加,而且灭活E2的活性也显著增加。4炎症因子与HSD17B4的表达呈一定的线性正相关Real-time PCR结果显示,IL-6和TNF-α在HCC组中m RNA水平的表达量显著高于NC组。用Pearson correlation test方法,二者m RNA和HSD17B4m RNA的表达量之间相关性分析结果显示,HSD17B4与IL-6 m RNA的表达量呈正相关(r2=0.6233,P<0.05),与TNF-α有较弱的正相关性(r2=0.2281,P<0.05)。因此我们推测,HSD17B4的表达很可能与炎症的加剧有关。5增殖相关基因与HSD17B4的表达呈一定的线性正相关Real-time PCR结果显示,cyclin D1和PCNA在HCC组中m RNA水平的表达量显著高于NC组。用Pearson correlation test方法,二者m RNA和HSD17B4 m RNA的表达量之间相关性分析结果显示,HSD17B4与cyclin D1(r2=0.4053,P<0.01)和PCNA(r2=0.4925,P<0.01)m RNA的表达量呈正相关(Fig.5 C,D)。因此我们推测,HSD17B4表达的增加有可能与癌细胞的增殖有关。小结:HCC大鼠肝癌组织中HSD17B4表达及活性显著增加。HSD17B4的表达与炎症因子和增殖相关基因的表达呈正相关性。第二部分NF-κB上调HSD17B4的表达进而灭活雌二醇促进Hep G2细胞的增殖目的:以HepG2细胞为实验对象,验证HSD17B4与NF-κB,E2以及细胞增殖之间可能存在的联系。另外,我们也以人肝癌组织为对象,证明HSD17B4与NF-κB的关系。方法:1利用CCK-8分析和Brd U掺入检测HSD17B4的促增殖功能。2 Western blotting检测增殖基因cyclin D1、PCNA表达,以及TNF-α刺激对HSD17B4表达的影响。3 Real-time PCR检测TNF-α刺激对HSD17B4和NF-κB的靶基因IL-6、IL-8转录水平的影响。4报告基因分析和点突变实验检测激活的NF-κB通过作用于HSD17B4上游site A元件影响其转录激活。5 Ch IP和Oligo pull down实验验证NF-κB与HSD17B4上游site A元件特异性结合。6放射免疫分析检测E2的改变。7免疫荧光检测人肝癌与癌旁组织中HSD17B4表达的差异。8用原位杂交联合免疫荧光的方法,验证人肝癌与癌旁组织中激活的NF-κB与HSD17B4上游的site A元件的结合的差异。结果:1 HSD17B4表达增加促进了Hep G2细胞的增殖CCK-8分析和Brd U掺入实验证明,HSD17B4过表达和敲低能相应的增加和减少细胞的数量,并且相应的正向调节cyclin D1和PCNA的蛋白表达。这些结果就说明,HSD17B4能够影响Hep G2细胞的增殖。2 Hep G2细胞中HSD17B4表达的增加伴随着NF-κB的激活HSD17B4的蛋白水平以及入核的NF-κB p65蛋白量均随TNF-α浓度的增加呈剂量依赖性增加。同时,伴随着NF-κB靶基因IL-6和IL-8的m RNA表达的增加,HSD17B4的m RNA水平也随之呈剂量依赖性增加。PDTC在抑制由TNF-α引起的NF-κB p65蛋白的入核的同时,也能够有效抑制HSD17B4的蛋白表达以及m RNA的表达。si NF-κB p65处理降低了HSD17B4蛋白水平以及m RNA水平的表达。以上结果就证明,NF-κB的活化能够促进HSD17B4的表达。3激活的NF-κB直接结合在HSD17B4上游NF-κB结合位点促进HSD17B4的表达报告基因分析结果显示,转染site AB-wt质粒的细胞荧光素酶的激活在TNF-α诱导之后显著增加,并且PDTC的预处理能够有效抑制由TNF-α引起的增加。然而转染site B-wt质粒的细胞对刺激因素并没有产生显著地变化。位点突变试验也同样证明了site A对HSD17B4转录激活的重要性。说明存在于HSD17B4上游site A对于介导TNF-α引起的HSD17B4的转录激活发挥了重要的作用。Ch IP实验结果显示,TNF-α处理可以显著增加site A与NF-κB p65的结合,而PDTC可以使此结合显著降低;同样条件下,NF-κB激活或抑制却不能改变site B与NF-κB p65的结合。Oligo pull down进一步证明了TNF-α激活NF-κB增加了NF-κB p65与site A探针结合的特异性。通过以上的实验就进一步说明,在Hep G2细胞中由TNF-α诱导活化的NF-κB通过结合在HSD17B4上游的site A位点来促进其转录表达。4由活化的NF-κB上调的HSD17B4表达降低了E2的水平我们通过检测HSD17B4对外源性E2的转化,反应HSD17B4的催化活性。与对照组相比,TNF-α处理和HSD17B4过表达之后能够显著降低培养基中E2的水平。通过外源加入E1和E2处理细胞发现,肝癌细胞增殖是E2的作用,而不是E2的转化产物E1的作用。以上这些结果说明,NF-κB上调HSD17B4的表达,促进Hep G2细胞的增值是E2水平降低的结果。5 HCC人肝癌组织中激活的NF-κB与HSD17B4上游site A位点结合增加,上调了HSD17B4的表达免疫荧光的结果显示,HSD17B4在HCC患者肿瘤组织的中的表达明显高于癌旁组织。原位杂交和免疫荧光相结合的实验结果显示,肿瘤组织中不仅活化的NF-κB入核增多,而且与HSD17B4上游区元件site A结合的量也明显增加。说明HSD17B4的高表达,是由活化的NF-κB结合在HSD17B4上游NF-κB结合元件所致。小结:在肝癌细胞中HSD17B4是NF-κB的下游靶基因。TNF-α激活NF-κB促进了HSD17B4的表达。Hep G2细胞中HSD17B4通过灭活E2发挥促增殖的功能。第三部分过表达HSD17B4促进Hep G2细胞的增殖与STAT3的激活有关目的:检测过表达或敲低Hep G2细胞的HSD17B4对增殖相关信号途径关键分子以及STAT3的磷酸化的影响,进一步证实HSD17B4促肝癌细胞增殖的作用方法:1免疫双荧光共定位检测HSD17B4的细胞定位。2 Western blotting检测p-STAT3、p-Akt、p-MEK和p-ERK的蛋白表达。3免疫组化检测HSD17B4和p-STAT3在HCC患者肝脏中的表达。4用spearman correlation test对HSD17B4与p-STAT3免疫组化的灰度值进行相关性分析。结果:1过表达的HSD17B4定位于胞浆中转染空质粒(Empty)中TRITC标记的HSD17B4(绿色)与FITC标记的PMP70(红色)相互重合为黄色荧光,而同样的条件下,RITC标记的HSD17B4(绿色)与FITC标记的GAPDH(红色)不能相互重合为黄色荧光。证明静息状态下HSD17B4定位于过氧化物酶体。转染HSD17B4过表达质粒或用TNF-α刺激细胞,过表达HSD17B4后,TRITC标记的HSD17B4(绿色)与FITC标记的PMP70(红色)不能完全相互重合为黄色荧光。然而,TRITC标记的HSD17B4(绿色)与FITC标记的GAPDH(红色)却大部分相互重合为黄色荧光。说明过表达的HSD17B4多数定位在细胞质中。2 HSD17B4的过表达促进了STAT3的激活分别过表达和敲低HSD17B4,能相应的显著增强或减少STAT3的磷酸化水平,证明了HSD17B4对STAT3激活的正向调节。通过对16例HCC患者肝癌组织样本中,p-STAT3和HSD17B4的免疫组化结果的灰度值分析证实,p-STAT3与HSD17B4的表达水平呈正相关(r2=0.6359,P<0.01)。3 HSD17B4的过表达促进了Akt和MEK/ERK的磷酸化激活通过对Akt,MEK,ERK,p38,JNK激酶活性的Western blotting检测,过表达或敲低HSD17B4能使Akt,MEK和ERK的磷酸化水平显著增加或降低,但是p38和JNK的激酶活性并没有改变。而当我们用Akt的抑制剂LY294002和MEK/ERK的抑制剂PD98059预处理HSD17B4过表达的细胞,则有效地降低了由HSD17B4过表达引起的p-STAT3的表达水平。这就说明HSD17B4过表达后,细胞的增殖与Akt和MEK/ERK激活促进STAT3的活化有关。进一步证明了HSD17B4具有促肝癌细胞增殖的作用。小结:过表达的HSD17B4大部分定位于胞浆,灭活E2。HSD17B4失活E2,引起了Akt和ERK信号途径激活,使STAT3活化而促进HCC的增殖。HSD17B4有促肝癌细胞增殖的作用。结论:肝癌细胞中高表达的HSD17B4通过灭活E2促癌细胞增殖。