膀胱肿瘤特异性溶瘤腺病毒基因靶向治疗与放疗的协同作用

来源 :兰州大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jxy_su261314
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目的:治疗膀胱肿瘤的方法包括手术治疗,放射治疗,化疗,然而对于复发和转移了的膀胱癌的治疗效果是不理想的。基因治疗是提高肿瘤治疗效果的重要的途径之一。放射敏感性是决定肿瘤放射治疗成败的关键。本研究旨在以组织特异性溶瘤腺病毒转染膀胱肿瘤细胞为观察体系,阐明膀胱癌特异性溶瘤腺病毒与放疗联合治疗膀胱癌的协同作用并且同时探讨其协同作用的机制。方法:常规培养膀胱肿瘤细胞株BIU-87和EJ。采用空斑形成实验(PFU)等方法测定重组病毒的滴度和纯度;用显微照相法观察腺病毒作用肿瘤细胞后发生了溶瘤作用(CPE);用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测腺病毒和/或放疗不同时间点对膀胱肿瘤细胞增殖的影响;用capase3活性检测试剂盒(Beyotime)检测腺病毒与放射联合对膀胱癌肿瘤细胞凋亡情况的影响;应用细胞流式分析检测腺病毒和/或放射作用膀胱肿瘤细胞后细胞周期和凋亡情况;通过透射电镜观察腺病毒颗粒进入到肿瘤细胞内的分布情况和其引起的肿瘤细胞的形态和亚细胞结构的变化;应用蛋白免疫印迹法检测DAN损伤修复通路蛋白MRE11, γ-H2AX-Ser139, chk2-thr68及溶瘤腺病毒受体(CAR)、腺病毒早期基因(E1A)相对表达量的变化;用QuickTiterTM Adenovirus Titer Kit检测照射是否增加了感染膀胱癌肿瘤细胞后的膀胱癌腺病毒的滴度。结果:空斑形成实验(PFU)实验证实特异性溶瘤腺病毒有很高的纯度和滴度,并且通过效应基因E1A产生了溶瘤效应。显微照相镜下观察膀胱特异性溶瘤腺病毒感染膀胱肿瘤细胞株BIU-87和EJ后,肿瘤细胞株出现了CPE效应。MTT法测定出了放射治疗和腺病毒之间协同作用的时间点的选择,同时可以观察到联合治疗组的膀胱肿瘤细胞株BIU-87和EJ的增殖率低于单独用病毒感染或照射组的膀胱癌细胞株的增值率,并且随着射线剂量的增长和作用时间的延长而降低。Capase3活性实验证实联合治疗组的膀胱癌细胞的凋亡率高于单独病毒感染或照射组的膀胱癌细胞的凋亡率,并且随着射线剂量的增加凋亡率增加。细胞流式分析证实膀胱癌细胞株受干预后,细胞周期被阻滞在G2/M期。电子透镜显示出了进入到膀胱癌细胞内的溶瘤腺病毒呈六边形或者散在存在,单独放疗组引起了膀胱癌细胞的形态和结构的改变,细胞内还可以看到凋亡小体的存在western blotting得出DAN损伤修复通路蛋白MRE11,γ-H2AX-Ser139, chk2-thr68的变化:联合治疗组相对于单独照射的膀胱癌细胞中MRE11和chk2-thr68蛋白是降低的,y-H2AX-Ser139蛋白是升高的,联合治疗组中溶瘤腺病毒E1A基因伴随着科萨其受体CRA的表达的升高而升高,同时腺病毒外壳的六邻体蛋白也是升高的。照射组比较于腺病毒感染组,腺病毒滴度并未出现变化。结论:这篇文章得出特异性溶瘤腺病毒基因靶向治疗与放疗联合治疗膀胱癌具有协同作用,同时提出了协同作用的一种分子机制研究,证实了协同机制与DNA损伤修复通路蛋白有关联,同时也为腺病毒基因治疗联合放射治疗协同抗肿瘤的治疗策略提供了证据。
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