防治玉米大斑病的候选靶标-CFEM效应蛋白的挖掘

来源 :河北农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ahfnhui
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玉米作为粮食界的三大巨头之一,也是中国农业经济的主导。玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica,俗称大斑刚毛座腔菌)可引起玉米大斑病,严重发生年份可导致大幅度减产。CFEM(Common in several Fungal Extracellular Membrane protein)结构域是真菌中独有的结构域,约含有60个氨基酸,每个结构域通常包含8个半胱氨酸,其中,一些能够被分泌到胞外的CFEM蛋白被证明是病原真菌效应蛋白,与病菌的致病性密切相关。本研究对玉米大斑病菌中CFEM蛋白家族进行探究,并对其中潜在的效应蛋白进行鉴定和作用机制分析。主要研究结果如下:1.通过对玉米大斑病菌基因组数据库进行同源搜索,获悉其CFEM家族有13个成员,在 JGI 数据库中的 ID 分别为 80947、28123、181030、165528、165307、162727、139432、128616、128580、164784、135770、1432023 和 1428406,并将其分别命名为 StCFEM1、StCFEM2、StCFEM3、StCFEM4、StCFEM5、StCFEM6、StCFEM7、StCFEM8、StCFEM9、StCFEM10、StCFEM11、StCFEM12 和 StCFEM13。2.利用生物信息学方法对13个基因结构特点进行分析,CFEM结构域的序列比对和WebLogo分析表明,StCFEM氨基酸高度保守,除StCFEM1、2、3和6外,整体上含有8个典型的半胱氨酸;系统发育分析表明,根据有无跨膜结构域的存在,13个蛋白(StCFEM1-13)可分为2个分支,其中6个有信号肽且无跨膜结构域的StCFEM蛋白(StCFEM3,4,5,10,12,13)被假定为候选效应蛋白;对蛋白三级结构进行预测,发现候选效应蛋白的CFEM结构域可以形成螺旋结构,与白色念珠菌(Candida albicans)Csa2 同源。3.对玉米大斑病菌CFEM家族进行转录组分析,结果表明,6个候选基因在真菌侵染寄主过程中不同时期均表达,其中SCFEM3、4、5和12在附着胞形成时期表达活跃。4.借助pSuc2t7M13or酵母分泌系统来鉴定候选效应蛋白的分泌功能,结果发现,6个候选效应蛋白均具有很强的分泌功能,属分泌蛋白。5.利用烟草瞬时表达系统鉴定效应蛋白,结果表明,StCFEM3、4和5对BAX/INF1诱导的本氏烟草程序性细胞死亡(PCD)没有影响,而StCFEM12可以抑制INF1诱导的PCD,但对BAX诱导的PCD没有影响。6.构建StCFEM12与GFP融合表达载体,利用共聚焦显微镜观察该效应蛋白的亚细胞定位,发现StCFEM12::GFP定位于烟草叶肉细胞的叶绿体。7.以StCFEM12为诱饵蛋白,从玉米叶片cDNA的酵母双杂交文库筛选,获得17个与StCFEM12互作的候选蛋白,其中包括Shaggy-related protein kinase、铁氧化还原蛋白(Ferredoxin l)、甲硫氨酸腺苷转移酶(Methionineadenosyltransferase)、丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)和 乙烯途径 ACC 氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase)等。通过酵母双杂交技术进行互作关系验证,明确了 Ferredoxin 1、ACC氧化酶与StCFEM12存在物理互作关系。综上所述,本研究发现玉米大斑病菌(S.turcica)CFEM蛋白家族共有13个成员,其中StCFEM12具有效应蛋白活性,与玉米的Ferredoxin 1、乙烯途径ACC氧化酶中互作。为阐明CFEM蛋白在植物病原真菌致病过程中的作用机制奠定了基础。
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