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肝纤维化（hepatic fibrosis,HF）是多种损伤因素（包括,病毒感染,药物性损伤,酒精滥用,高脂饮食等）持续作用于肝脏引起的损伤-修复反应,其主要特征是大量的细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）沉积在肝脏中,引起肝脏结构和功能紊乱。如果不及时治疗,肝纤维化会进一步发展为肝硬化,甚至肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）,给社会带来沉重的经济负担。肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSCs）活化,是肝纤维化进程中的主要事件,活化的肝星状细胞是合成ECM的主要细胞。转化生长因子-β（Transforming growth factor-β,TGF-β）是诱导肝星状细胞活化的最主要的细胞因子,抑制肝星状细胞的活化增殖,或者促进其凋亡是目前肝纤维化的主要治疗策略。大量的研究表明,表观遗传学修饰在肝纤维化疾病中起到重要的调节作用。本课题组前期在肝纤维化小鼠中进行了基因组甲基化筛选,实验结果表明,PTGIS基因在模型组中的甲基化水平异常增高,此结果提示我们,PTGIS可能参与肝纤维化疾病进程。PTGIS（prostacyclin synthase）是前列环素合成酶,是CYP450家族的成员之一,其可以催化PGH2转化为PGI2。这些结果表明,PTGIS在肝纤维化疾病进程中起重要作用,为进一步探究肝纤维化潜在的治疗靶点提供一个新的思路。此课题的研究内容主要包括以下七个部分:1.PTGIS在肝纤维化小鼠模型中的表达变化动物实验:雄性C57BL/6j小鼠16只（体重18-22 g,6-8周龄）,随机分为对照组（Vehicle group）和肝纤维化模型组（CCl4-treated group）,每组8只。我们采用腹腔注射10%CCl4橄榄油溶液。在最后一次注射CCl4 24 h之后,麻醉小鼠,收集小鼠血液样本和肝脏样本,原位灌流提取小鼠原代肝星状细胞用于后续的实验。通过肝脏大体观,血清ALT/AST水平,H&E染色检测肝脏损伤情况;通过Masson染色检测胶原沉积情况;通过α-SMA的免疫组化染色来检测肝星状细胞的活化情况。通过免疫组化（IHC）,Western blot,RT-qPCR实验检测PTGIS在肝纤维化疾病进程中的表达变化;通过免疫荧光双染来检测PTGIS与α-SMA的共定位情况。实验结果表明:肝纤维化小鼠模型构建成功,PTGIS在肝纤维化小鼠肝脏中表达降低,且PTGIS与α-SMA存在共表达的位点,说明其在肝星状细胞中有表达。2.在肝纤维化疾病进程中,PTGIS的表达变化情况动物实验:雄性C57BL/6j小鼠72只,随机分为对照组（Vehicle group）和肝纤维化模型组（CCl4-treated group）,每组36只,按照上述造模方法构建小鼠肝纤维化模型。在造模过程中,每周造模结束后,分别从两组中各拿出6只小鼠,收集血液以及肝脏样本,原位灌流提取原代肝星状细胞。收集的标本放在-80℃冰箱中储存,至收集完所有的样本后进行后续的检测。通过血清ALT/AST水平,H&E染色,Masson染色来检测肝脏损伤程度,胶原沉积情况,肝星状细胞的活化情况;通过Western blot,RT-qPCR技术检测肝纤维化疾病进程中PTGIS,COL1a1,α-SMA的表达变化情况。实验结果表明:小鼠肝脏纤维化程度随着造模时间的延长而逐渐加重;PTGIS的表达呈现先升高后降低的趋势。3.体外肝纤维化模型中检测PTGIS的表达变化情况体外实验:通过不同浓度的TGF-β1（0,5,10,15 ng/mL）刺激大鼠肝星状细胞（HSC-T6）作用于24 h,或者同样浓度的TGF-β1（10 ng/mL）刺激不同的时间点（0,6,12,24,48 h）来探究TGF-β1诱导HSC-T6细胞活化的最佳作用浓度以及最佳作用时间。通过Western blot和RT-qPCR实验检测PTGIS,COL1a1和α-SMA的表达变化情况。通过免疫荧光染色技术检测PTGIS在HSC-T6细胞中的表达变化情况及其在肝星状细胞中的表达量的变化。实验结果表明:TGF-β1诱导HSC-T6细胞活化的最佳作用浓度及最佳作用时间是10 ng/mL,24 h;在TGF-β1诱导体外肝纤维化模型中,PTGIS在细胞质中表达且其表达降低。4.PTGIS的表达降低与其启动子区域发生甲基化有关并且DNA甲基化转移酶抑制剂（5-azadC）及DNA甲基化转移酶小干扰RNA（DNMTs-RNAi）可以提高其在纤维化模型中的表达。我们首先通过软件预测了PTGIS基因中易发生甲基化的位点,结果表明PTGIS基因中具有3个CpG位点。通过甲基化特异性PCR（MSP）实验检测PTGIS基因在肝纤维化模型中甲基化水平。通过Western blot实验检测了体内体外肝纤维化模型中,DNMTs的表达水平及PTGIS的表达水平。在体外实验中,应用DNA甲基化转移酶抑制剂（5-azadC）以及DNA甲基化转移酶小干扰RNA（DNMT-RNAi）,检测抑制或者沉默DNMTs之后,对PTGIS的表达水平的影响。通过染色质免疫共沉淀（ChIP）实验,检测了诱导PTGIS基因发生甲基化的DNA甲基化转移酶。实验结果表明:在肝纤维化疾病进程中,PTGIS基因发生甲基化;且PTGIS基因甲基化是由DNMT1和DNMT3b介导的。5.在体肝脏特异性过表达PTGIS可以改善肝纤维化的病理进程体内实验:雄性C57BL/6j小鼠24只,随机分为3组,空病毒处理的对照组（rAAV8-empty-treated Control group）空病毒处理的模型组（rAAV8-empty-treated Model group）和PTGIS过表达病毒处理的模型组（rAAV8-PTGIS-treated Model group）。通过尾静脉注射空病毒载体（rAAV8-empty）或者包裹了PTGIS过表达质粒的重组腺相关病毒（rAAV8-PTGIS）。注射病毒一个星期之后,开始按照前面描述的造模方法构建肝纤维化小鼠模型。通过肝脏大体观,病理切片（H&E染色）及血清ALT/AST水平来检测来探究肝脏损伤程度;通过小鼠新鲜肝脏组织冰冻切片中绿色荧光蛋白信号及PTGIS的表达变化来鉴定病毒是否成功感染到肝脏中,是否成功诱导PTGIS的过表达;通过H&E染色,Masson染色、α-SMA的免疫组化和Western blot来检测纤维化指标变化情况。实验结果表明:在模型组小鼠肝脏中过表达PTGIS之后,可以改善肝纤维化病理进程,胶原沉积减少,α-SMA表达减少。6.在HSC-T6细胞及原代HSCs中过表达PTGIS对肝星状细胞的增殖及凋亡的影响构建PTGIS过表达质粒,通过转染试剂Lip2000转染入HSC-T6细胞,TGF-β1（10 ng/mL）诱导肝星状细胞活化。通过Western blot及RT-qPCR检测过表达效率以及其对COL1a1及α-SMA的表达变化的影响;CCK8实验用来检测过表达PTGIS对HSC-T6细胞活性的影响;流式细胞术用来检测过表达PTGIS对HSC-T6细胞周期和凋亡的影响;Western blot实验用来检测PTGIS对周期和凋亡相关蛋白表达变化的影响。实验结果表明:在HSC-T6细胞中过表达PTGIS可以降低COL1a1及α-SMA表达,并通过将细胞阻滞在G0/G1期而发挥抑制细胞增殖的功能,并且过表达PTGIS可以促进活化的HSC-T6细胞凋亡。在原代肝星状细胞中的结果与体外实验结果一致。7.在HSC-T6细胞中沉默PTGIS对肝星状细胞增殖及凋亡的影响构建PTGIS小干扰RNA（RNAi）,使用转染试剂Lip2000转染入HSC-T6细胞,然后用TGF-β1（10 ng/mL）诱导肝星状细胞活化。通过Western blot及RT-qPCR检测过沉默效率以及其对COL1a1及α-SMA的表达变化的影响;通过FCM来检测沉默PTGIS对HSC-T6细胞的增殖和凋亡的影响;通过CCK8实验检测沉默PTGIS之后对HSC-T6活性的影响;通过Western blot实验检测沉默PTGIS对周期蛋白（Cyckin D1和C-myc）和凋亡蛋白（Bax,Bcl2和cleaved-caspase3）的表达变化的影响。实验结果表明:在HSC-T6细胞中沉默PTGIS可以提高纤维化指标COL1a1及α-SMA的表达,提高周期相关蛋白C-myc,Cyclin D1的表达,对凋亡相关蛋白Bax,Bcl2,Cleaved-caspase 3的表达的影响不具有统计学意义。