生物节律普遍存在于机体细胞中且对细胞周期、增殖、凋亡均存在一定的调控作用。另外，有研究证实，生物钟基因和脂质合成之间有密切联系，但是，其具体的调控作用机理尚不明确。因此，本研究通过沉默生钟基因PER2的表达来探究PER2基因对细胞周期调控因子及细胞增殖、凋亡的调控作用，以及生物节律与奶牛乳腺上皮细胞乳脂肪合成的关系及其分子调控机制。　　试验一、奶牛乳腺上皮细胞PER2基因沉默效果及其对节律基因表达的影响　　本试验选择奶牛作为试验动物，采用胶原酶消化法对奶牛乳腺组织进行分离培养，得到的原代乳腺上皮细胞可为后续试验提供材料。本试验共构建三组siRNA干扰序列(siRNA-PER2-a/b/c)对奶牛乳腺上皮细胞进行转染，用Real-time PCR技术对不同序列的干扰片段及其在5个时间点的PER2mRNA表达量作为评价转染效率的依据，并筛选出沉默效果最佳的干扰片段和转染时间点，以此作为后续沉默处理的条件。同时，用Real-time PCR对其它生物钟相关基因的mRNA水平进行测定。结果显示，筛选出干扰片段siRNA-PER2-b在36h沉默效果最佳，PER2基因的沉默效率达到84.7％。另外，对生物钟网络基因的测定结果发现，PER2沉默显著下调了PER1、CLOCK、CRY2、BAML1、NR1D1和Timeless基因的mRNA表达量(P＜0.05），但对CRY1和RORA的mRNA表达量的影响并不显著(P＞0.05)。因此，PER2基因沉默在一定程度上千扰了奶牛乳腺上皮细胞的生物钟节律。　　试验二、节律基因PER2沉默对奶牛乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响　　本试验通过PER2干扰片段转染奶牛乳腺上皮细胞来比较PER2沉默对细胞增殖和凋亡的影响。用CCK8测定细胞增殖活性，用流式细胞仪检测各组细胞凋亡和细胞周期分布情况，，用RT-PCR检测各组细胞中细胞周期相关基因和凋亡通路基因的mRNA表达。结果显示，cck8测定细胞增殖活力结果并不显著（P＞0.05）。流式细胞术测定细胞周期结果显示，PER2基因沉默后S期细胞数显著减少(P＜0.05），G0/G1期细胞数目显著增加(P＜0.05），细胞增殖指数显著下降(P＜0.05）。此外，PER2基因沉默能够显著下调细胞周期基因CDK1、CDK2、CDK4、CyclinB1、CyclinD1、Cdc25B和C-cym的mRNA表达水平(P＜0.05），对CDK6没有显著影响(P＞0.05)。PER2沉默对细胞凋亡指数的影响不显著(P＞0.05），但在细胞凋亡相关通路中，PER2沉默显著上调了Caspase8基因的mRNA表达(P＜0.05），对于Caspase3和P53影响不显著(P＞0.05)。　　试验三、节律基因PER2沉默对奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成的影响　　本试验旨在探究PER2沉默对脂滴、甘油三酯和乳脂代谢相关基因的影响。用油红O染色进行脂滴合成和脂滴光密度检测，用甘油三酯酶法测定乳腺上皮细胞甘油三酯含量，RT-PCR检测脂质代谢相关基因的mRNA表达。结果显示，PER2基因沉默显著降低了乳腺上皮细胞脂滴的积累(P＜0.05），另外，PER2基因沉默显著降低了细胞甘油三酯含量(P＜0.05)。同时，PER2基因沉默可以显著降低转录调节因子SREBF1和PPARG的mRNA表达量(P＜0.05），并能够显著下调脂肪酸从头合成相关基因(ACC、ACACA、FAS)的表达(P＜0.05)，显著下调脂肪酸去饱和基因(SCD)，甘油三酯合成基因(LPIN1、SCD)，脂滴分泌基因(LPIN1）的mRNA表达（P＜0.05），但对脂肪酸的摄取和转运基因(LPL）表达没有显著影响(P＜0.05）。　　综上，1）PER2沉默能够下调部分生物钟相关因子和周期调控基因的mRNA表达，并主要通过抑制CyclinD1与CDK4的表达阻滞细胞从G0/G1期向S期转换，抑制有丝分裂的进行。2）PER2基因沉默显著抑制了细胞增殖指数，但对细胞凋亡指数的影响不显著，但在细胞凋亡相关通路中，PER2沉默显著上调了Caspase8基因的mRNA表达。3)PER2基因沉默可以通过抑制转录调节因子SREBF1和PPARG的表达来调控脂肪酸的从头合成、脂肪酸的去饱和、甘油三酯的生成以及脂滴的分泌。